マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離
Summary
このプロトコルの目的は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、ヒトのリンパ奇形嚢胞様血管および包皮を裏打ちするリンパ管内皮細胞を単離することです。その後の細胞培養およびこれらの細胞の拡大は、遺伝的プロテオミクス、機能および細胞分化の研究のための実験的な洗練の新しいレベルを可能にします。
Abstract
このような一次リンパ浮腫、リンパ管腫やリンパ性腫瘍のようなリンパ系障害は、重大な病的状態を引き起こすが、少しは、その生物学について知られているまれな条件です。罹患および健常組織から高純度のヒトリンパ管内皮細胞（LECの）を単離することは、遺伝的分子·細胞レベルでのリンパ内皮の研究を促進するであろう。それは、これらの調査は、これらの条件の臨床管理を変更することができる新しい治療のターゲットを公開してもよいことが予想されます。のLECとリンパ奇形リンパ管内皮細胞（LMのLEC）ヒト包皮の分離を説明するプロトコルが提示されています。単一細胞懸濁液の組織を得るために刻み、酵素ディスパーゼIIおよびコラゲナーゼIIを用いて処理しました。得られた単一細胞懸濁液は、次いで、分化（CD）マーカーCD34、CD31、血管内皮増殖因子-3（VEGFR-3）およびポドプラニンのクラスタに対する抗体で標識しました。スタイNED生存細胞は、他の内皮細胞及び非内皮細胞からCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位 LM LEC集団を分離するために、蛍光活性化セルソーター（FACS）で選別しました。ソートLMのLECを培養し、さらに実験的な使用のためのフィブロネクチンコートフラスコに拡大しました。
Introduction
リンパ脈管系の主な機能は、リンパ液、脂質、タンパク質、および細胞成分を含む過剰な間質液を吸収し、血液の静脈系にそれを行うことです。リンパ毛細管のネットワークが、それは外来抗原の存在についてスクリーニングされたリンパ節に外来抗原を中和する白血球の免疫監視および展開における重要なプロセスをリンパ節を導きます。
片方向リンパ系は、初期リンパ毛細管、リンパエントリ1,2を許可する特殊な細胞間結合を有する薄肉のフラット内皮細胞の不連続な単層を持つユニークな構造を持つ組織で起動します。これらの毛細血管は、増大した間質圧3の存在下での血管の崩壊を防止するためにフィラメントをアンカーを介して隣接する結合組織マトリックスに取り付けられています。毛細リンパ管の収集に空の初期リンパ毛細血管それは、より大きなリンパ管や静脈に合体します。リンパ毛細血管初期と比較して、収集リンパ管は、太い血管の壁を有するリンパバルブをペアにし、いくつかの平滑筋細胞を4埋め込 まれた不連続な基底膜によって包まれています。平滑筋細胞のリンパバルブおよび収縮の協調開閉は3リンパの流れを促進します。胸管と右リンパ管：ヒトでは、身体の様々な領域からのリンパ静脈は2リンパ管を形成するためにマージリンパトランクを形成するために結合します。胸管は、胸下の体の左側から、右側からリンパ液を排出しながら、頭、首、及び胸部の右腕と右側から右リンパダクトドレインリンパ。両方のダクトは頸部5に鎖骨下静脈にリンパ節を行っています。
リンパ系の障害は、広く取得Aに分類されていますND先天性（ 表1）。取得した状態の例にはリンパ管炎および二次性リンパ浮腫です。リンパ管炎は細菌感染によるリンパ管の炎症です。影響を受けたリンパ管が拡張し、多形核細胞を含む滲出液で満たします。皮膚では、これらのリンパ管は、多くの場合、関連する排出リンパ節（リンパ節炎）6の拡大に伴う赤、痛みを伴う皮下スジとして表示されます。二次性リンパ浮腫は、リンパ管やリンパ節障害物への損傷や閉塞の結果として生じます。これは、損傷や障害物へのリンパ遠位の蓄積による慢性進行性の腫れにつながります。先進国では、二次リンパ浮腫は、最も一般的転移腫瘍は、照射後の線維症および炎症後throm、リンパ管または所属リンパ節を妨げ、またはリンパ節の外科的除去後の抗癌療法の結果として悪性度と関連していますbosisおよび瘢痕化7。世界の他の地域では、二次性リンパ浮腫は、 バンクロフト糸状虫 6などの寄生虫によって引き起こされるリンパ管閉塞に続発することができます。
| リンパ血管系の障害 | |||
| 獲得しました | 先天性の | ||
| リンパ節炎 二次性リンパ浮腫 | 一次リンパ浮腫10 | 孤発性リンパ管腫13 | 症候群13とリンパ管腫関連 |
| 例えば ミルロイ症候群 Meige症候群 | シンプル ： リンパ管腫 | 例えば クリッペルTranaunay症候群 公園ウェーバー症候群 スタージ – ウェーバー症候群 | |
| 組み合わせ ： 毛細管リンパ管腫 毛細血管、リンパ静脈奇形 毛細血管、リンパ、動静脈奇形 毛細血管、リンパ静脈、動静脈奇形 | |||
リンパ血管系の障害の表1.概要。
リンパ系の先天性障害は、遺伝的変異、リンパ管拡張症とリンパ系の8,9の異常によって引き起こされると考えられ、一次（特発性）リンパ浮腫が含まれます。一次性リンパ浮腫は、おそらく新生突然変異によって引き起こさ、または継承された散発的であることができます。リンパ障害はまた、単離されたまたはより一般症候群10の一部を構成することができます。小児集団は、リンパの97％浮腫は所属リンパドレナージ11を損なうリンパ管構造の異常と散発的です。ミルロイ病は、出生時に明らかまたは直後に12 VEGFR-3遺伝子の変異によって引き起こされる主要なリンパ浮腫の一例です。主に家族の条件が、ミルロイ病もミルロイ病32の家族歴のない幼児で同定することができます。任意のリンパ浮腫の重症度は、リンパの生産とバック静脈循環6にリンパ液を輸送する能力の量に依存します。
臨床症状にその場内皮細胞増殖に基づいて、リンパ系の異常はリンパ性腫瘍やリンパ管腫13に分類されます。 Kaposiformリンパ管腫は、LEC、腫瘍14の一例です。リンパ管腫は、胚発生の間に生じ、子供15,16に比例して成長すると考えられています。彼らはめったに退行ないがremaiできますnは無症候性外傷や感染症が臨床的合併症につながる急速な成長を沈殿するまで。上記の静脈循環への組織からリンパ管網とリンパの伝導の秩序構造はリンパ液で満たされた異常な嚢胞構造の局所的なコレクションで構成されてリンパ管腫に乱されます。これらの嚢胞血管がリンパ循環にまたはそれらが機能的リンパ管のバルブを含んでいることが接続されていることは臨床的または実験的証拠はありませんが、それらのリンパのアイデンティティは、ポドプラニン、CD31、リンパ管内皮受容体1とリンパ細胞マーカーの範囲の発現により確認されています（LYVE-1）、プロスペローのホメオボックスタンパク質1（PROX-1）およびVEGFR-3 15,17,18。これらの嚢胞構造が小さい（microcystic）または（macrocystic）大のいずれかになりますが、ほとんどのリンパ管腫はmicrocysticとmacrocystic部品（ 図1）16の両方を含みます。手術後、充血nは硬化療法および/または無線周波数は、リンパ管腫は、しばしば再発アブレーション。
人間のリンパ管とリンパ管腫の図1形態。正常ヒトリンパ（A）とポドプラニン（茶色のラベル、矢印）に対する抗体で標識されたリンパ管腫の血管（BおよびC）。ヒトのリンパ奇形容器は著しい膨張内腔の大きさのかなりの変動によって特徴付けられます。これらのローカライズされた異常な嚢胞構造が小さい（microcystic、*）（B）または大（macrocystic、＃）（C）のいずれかであることができます。ほとんどのリンパ管腫はmicrocysticとmacrocystic成分の両方が含まれている。 図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 </ P>
一部の研究者は、リンパ管腫は、LECのが異常な成長の可能性を持っていないが、代わりに通常の循環19への接続に失敗している中で、リンパ脈管構造の発達障害を表すことを示唆しています。しかし、私たちは、LMのLECが速く増殖し、LECの15が LMのLECで一次欠陥があることを示唆している包皮よりもアポトーシスに対してより耐性であることを見出しました。 LMのLECは、マウス異種移植モデルに移植されている場合、それらは、リンパ管の奇形15を連想させる構造を形成します。これは、リンパ管腫は、胎児の発育中にLMのLECで生じる一つ以上の体細胞突然変異によって引き起こされることがあるという仮説を支持しています。実際、最近の報告では、ホスホイノシチド-3-キナーゼ（PIK3CA）遺伝子20のp110α触媒サブユニット内の1つのような変異を同定しました。
DNAシーケンシング技術は、関連する変異Cの進歩を考えるとより容易にこれらの条件の今後の研究を案内する、単離されたLMのLECで同定することがウルド。実行可能なLECの分離が減少栄養利用またはプロアポトーシス剤15に応答して、このような移動、増殖、管形成能と生存のようなアッセイにおける異常と正常のLEC間の比較を容易にするであろう。分離されたLECが、さらに新しいLECの亜集団を描写するために、細胞特異的な遺伝子発現およびプロテオミクス研究を行うために私たちを有効にし、リンパ管腫の臨床管理に適した新規薬剤を発見することになります。
我々は以前新生児包皮とリンパ管腫15からLECの磁気ビーズ分離に基づいて、LEC分離法を発表しています。我々は、CD31について陽性選択にCD34 Negの細胞画分を施し、続いてCD34発現の欠如に基づいて、血管内皮細胞からの正常および疾患のLECを分離する戦略を報告しました。しかし、この方法は、残留非内皮細胞の存在によって妨げられました。これは、従来、後続の結合組織消化に表皮を除去するとは無関係でした。これらの汚染物は、一般的に、最終的にLECの分離を繰り返し、後続の試みにもかかわらず、内皮細胞培養物をovergrewより迅速に、従って、増殖しました。実際には、2％〜5％と低い非内皮細胞の初期の汚染がLEC群15を圧倒するのに十分でした。これは、LEC細胞の収率および純度を改善するためのオプションとして、蛍光活性化細胞ソーティング方法を探るために私たちを促しました。さらに、我々はCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位のLECを識別するために、選択マーカーにVEGFR-3とポドプラニンを追加し、LEC集団の特異性を高めるためにソートマルチパラメータを使用していました。
これらのマーカーを選択するための理論的根拠は、報告される一方のLECと血液血管内皮CEに基づいていましたLLSは、CD31などの一般的な多くの細胞表面マーカーを有する血液の血管内皮細胞に21-23を比較した場合、LECが表現型CD34の発現の変化、ポドプラニンおよびVEGFR-3細胞表面マーカーを示します。 CD31はまた、血小板内皮細胞接着分子1（PECAM-1）としても知られている130 kDaの膜貫通糖タンパク質です。これは、それが血液およびリンパ管21,24,25のすべてのタイプで発現されるので、汎内皮細胞マーカーであると考えられています。 CD34は、ほとんどの造血前駆上の110 kDaの膜貫通糖タンパク質に存在し、細胞、血管内皮細胞およびいくつかのリンパ管26をステム。
VEGFR-3は、血管内皮細胞増殖のための受容体は、CおよびD因子、最初にマウス胚における現像静脈上に存在するが、転写によって調節リンパ仕様に従うことhicken C、SRY関連HMGボックス（SOX）-18因子O valbumin U pstreaM のp romoter t の ranscription Fの俳優 2（COUPTF-II）とPROX-1は、VEGFR-3の静脈の発現が失われ、それは、胚のLEC 25,27に限定となります。ポドプラニンは、38 kDaの膜は、ムコ蛋白、最初のマウス胚発生28のほぼ胚性リンパ管11日目（〜E11.0）に注目し、それを強く微小血管、リンパ管、リンパ管腫でmacrocysticリンパ内皮によってポドプラニンの式で表されている間15以上の変数です。フローサイトメトリー実験は、少なくともいくつかのCD34 高 CD31 順位内皮細胞は、リンパマーカーポドプラニン29を発現することを示唆しています。ヒトのリンパ管の奇形でLYVE-1およびポドプラニン染色の体系的評価の両方がリンパ奇形内皮細胞30を染色するのに有効であることを示したが、正常組織において、LYVE-1は、初期リンパ強く存在することが報告されました毛細血管内皮が、収集リンパ内皮31に減少し、さらには存在しません。私たちの目標として初期、我々は我々のセル選択戦略の一環として、LYVE-1を使用しないことを選択したリンパ管内皮細胞を収集の両方を単離することです。最後に、これらのマーカーを採用する決定はまた、顕微鏡イメージングのためのフローサイトメトリーおよび免疫蛍光研究との間の相関を可能にする機能をリンパ管を標識するために診断的に使用される抗体の利用可能性に基づいていました。
この記事では、組織消化法、細胞染色およびCD34 低 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位のLECならびに包皮とリンパ奇形からCD34 高 CD31 順位 VEGFR-3 順位ポドプラニン順位内皮細胞の正常な分離のために必要なFACSの設定を説明します組織。
Protocol
Representative Results
Discussion
LECが、外来抗原といくつかの栄養素の吸収と輸送に対する免疫応答を体液の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしています。 LEC恒常性は、細菌感染症および腫瘍転移などの疾患プロセスの影響を受けることができますが、LECが、また影響を受けた患者のための機能不全リンパ管の形成とかなりの罹患率につながる体細胞変異を開発することができます。 in vivoでの移植およびex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ベーカー財団とZerina Lokmicの支援ロイヤル子供財団科学フェローシップで女性を承認したいと思います。アンドリューG. ElefantyとエドゥアールG.スタンレーはNHMRC上級研究員です。彼らの研究室での作業は、NHMRCと幹細胞オーストラリアによってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
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