Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering
Summary
Målet med denne protokollen er å isolere lymfatiske endotelceller lining menneskelige lymfesystemet misdannelsescystelignende fartøy og forhud bruker fluorescensaktivert celle sortering (FACS). Påfølgende celledyrking og utvidelse av disse cellene tillater et nytt nivå av eksperimentell raffinement for genetiske, proteomikk, funksjonelle og celle differensiering studier.
Abstract
Lymfatiske lidelser som primær lymfødem, lymfatiske misdannelser og lymfatiske svulster er sjeldne tilstander som forårsaker betydelig sykelighet, men lite er kjent om deres biologi. Isolere svært rene menneskelige lymfatiske endotelceller (LMU) fra syke og friske vevet ville lette studier av lymfesystemet endotelet ved genetiske, molekylære og cellulære nivåer. Det er forventet at disse undersøkelsene kan avdekke mål for nye behandlingsformer som kan endre den kliniske behandlingen av disse tilstandene. En protokoll som beskriver isolering av humant forhuden LMU og lymfatiske misdannelses lymfatiske endotelceller (LM LECS) er presentert. For å få en enkelt celle suspensjon vev ble hakket og enzymatisk behandlet ved hjelp dispase II og kollagenase II. Den resulterende enkeltcelle-suspensjon ble deretter merket med antistoffer mot klynge av differensiering (CD) markørene CD34, CD31, vaskulær endotel vekstfaktor-3 (VEGFR-3) og PODOPLANIN. StaiNed levedyktige celler ble sortert på et fluorescensmerket aktivert cellesorterer (FACS) for å skille den lavt CD34 CD31 Pos VEGFR-3 Pos Pos PODOPLANIN LM LEC populasjon fra andre endotel- og ikke-endotelceller. De sorterte LM LMU ble dyrket og utvidet på fibronectin-belagt kolber for videre eksperimentell bruk.
Introduction
En viktig funksjon av det lymfatiske vaskulære systemet er å absorbere lymfe, et overskudd interstitiell væske som inneholder lipider, proteiner og cellulære komponenter, og lede den til den venøse blodsystemet. Et nettverk av lymfatisk kapillærer dirigerer lymfe til lymfeknuter der det er skjermet for tilstedeværelse av fremmede antigener, en viktig prosess i immunovervåkning og distribusjon av hvite blodlegemer til å nøytralisere fremmede antigener.
Den ensrettede lymfesystemet begynner i vev med den første lymfatisk kapillært, en unik struktur med en usammenhengende enkelt lag med tynne vegger flate endotelceller med spesialiserte celle veikryss som tillater lymfe oppføring 1,2. Disse kapillarene er festet til nabobindevevsmatrise via forankringsfilamenter for å hindre at fartøyet kollaps i nærvær av økt trykk interstitielt 3. De første lymfatiske kapillærene tømmes i innsamling lymfatiske kapillærersom vokser sammen til større lymfekar eller årer. I forhold til første lymfatiske kapillære fartøy, samle lymfekar har tykkere fartøy vegger, sammen lymfatiske ventiler og er omsluttet av en diskontinuerlig basalmembran der noen glatte muskelceller er innebygd 4. Samordnet åpning og lukking av ventiler og lymfatisk sammentrekning av glatte muskelceller forenkler strømning av lymfe 3. Hos mennesker lymfatiske årer fra ulike regioner av kroppen bli med å danne lymfatiske badebukser som fusjonere for å danne to lymfatiske kanaler: thorax kanalsystem og retten lymfatiske kanalen. Thorax duct drenerer lymfe fra venstre side av kroppen og fra høyre side under brystet mens den høyre lymfatiske kanal avløp lymfe fra høyre arm og høyre side av hodet, nakke og brystkasse. Begge kanalene gjennomføre lymfe inn i subclavia årer i nakken 5.
Forstyrrelser i lymfesystemet er bredt gruppert i ervervetnd medfødt (tabell 1). Eksempler på ervervede forholdene er lymphangitis og sekundære lymfødem. Lymfangitt er en betennelse i et lymfekar grunnet bakteriell infeksjon. De berørte lymfekar Utvid og fyll med sårvæsken inneholder polymorfonukleære celler. I huden, disse lymfekjertlene er synlige som rødt, smertefulle subkutane striper ofte ledsaget av utvidelse av den tilhørende drenering lymfeknute (lymfadenitt) 6. Sekundært lymfødem oppstår som følge av skade eller hindring for lymfekar eller lymfeknute obstruksjon. Dette fører til kronisk progressiv svelling på grunn av opphopning av lymfe distalt til skade eller blokkering. I utviklede land er sekundært lymfødem oftest assosiert med malignitet hvor metastasizing svulster hindre lymfekar eller regionale lymfeknuter, eller som følge av anti-kreft terapi etter kirurgisk fjerning av lymfeknuter, post-bestråling fibrose og post-inflammatorisk thrombosis og arrdannelse 7. I andre deler av verden, kan sekundære lymfødem være sekundært til lymfatisk obstruksjon forårsaket av parasittiske ormer som Wuchereria bancrofti 6.
| Forstyrrelser i Lymphatic karsystemet | |||
| Ervervet | Medfødt | ||
| Lymfadenitt Sekundært lymfødem | Primær Lymfødem 10 | Sporadiske lymfatiske Misdannelser 13 | Lymfatisk Misdannelser Associated med syndromer 13 |
| f.eks Milroy syndrom Meige syndrom | Enkelt: Lymfatiske misdannelser | f.eks Klippel-Tranaunay syndrom Parker Weber syndrom Sturge-Weber syndrom | |
| Kombinert: Kapillær-lymfatiske misdannelser Kapillær-lymfatisk-malformasjon Kapillær-lymfatisk-arteriovenøs malformasjon Kapillær-lymfatisk venøs-arteriovenøs malformasjon | |||
Tabell 1. Oversikt over de lidelser av lymfatisk karsystemet.
Medfødte sykdommer i lymfesystemet omfatter primær (idiopatisk) lymfødem antatt å være forårsaket av genetiske mutasjoner, lymphangiectasia og anomalier i lymfesystemet 8,9. Primær lymfødem kan være sporadisk antagelig forårsaket av de novo mutasjoner, eller arvet. Lymfatiske lidelser kan også være isolert eller utgjør en del av en mer generell syndrom 10. Hos barn, 97% av lymfeødem er sporadisk med unormalt i lymfekar struktur som svekker regional lymfedrenasje 11. Milroy sykdom er et eksempel på primær lymfødemer forårsaket av mutasjon i VEGFR-3-gen tydelig ved fødselen eller kort tid etter 12. Selv om det meste familiær tilstand, kan Milroy sykdommen også identifiseres i spedbarn uten familiehistorie med Milroy sykdom 32. Alvorlighetsgraden av enhver lymfødem er avhengig av mengden av lymfe produksjon og evne til å transportere lymfe tilbake til venøse sirkulasjon 6.
Basert på klinisk presentasjon og in situ endotelcelleproliferasjon, er anomalier av lymfesystemet klassifisert som lymfatiske svulster eller lymfatiske misdannelser 13. Kaposiform lymphangiomatosis er et eksempel på en LEC tumor 14. Lymfatiske misdannelser antas å oppstå under embryonal utvikling og vekst i forhold til barnet 15,16. De sjelden regress men kan remain asymptomatisk inntil trauma eller infeksjon utfellinger rask vekst fører til kliniske komplikasjoner. Den ryddig struktur av lymfatisk nettverk og gjennomføring av lymfe fra vevet til venøs sirkulasjon beskrevet ovenfor trengt på lymfatiske misdannelser som består av lokale samlinger av unormale cystisk strukturer fylt med lymfe. Mens det er ingen kliniske eller eksperimentelle bevis for at disse cystisk fartøyene er forbundet til det lymfatiske sirkulasjon eller at de inneholder funksjonelle lymfatisk ventiler, er deres lymfatisk identitet bekreftes ved ekspresjon av utvalget av lymfatiske cellemarkører som PODOPLANIN, CD31, lymfekar endotel Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) og VEGFR-3 15,17,18. Disse cystisk strukturer kan enten være liten (microcystic) eller stor (macrocystic), men de fleste lymfatiske misdannelser inneholde både microcystic og macrocystic komponenter (figur 1) 16. Etter operasjonen, injeksjonn sclerotherapy og / eller radiofrekvensablasjon lymfatiske misdannelser ofte oppstår på nytt.
Figur 1. Morfologi av menneskelige lymfekar og lymfatiske misdannelser. Normal menneskelig lymfatisk (A) og lymfatiske misdannelses skip (B og C) merket med antistoff mot PODOPLANIN (brun etikett, pil). Menneskelige lymfatiske misdannelses fartøy er preget av markant utvidelse og stor variasjon i lumen størrelse. Disse lokaliserte unormale cystisk strukturer kan enten være små (microcystic, *) (B) eller stort (macrocystic, #) (C). De fleste lymfatiske misdannelser inneholde både microcystic og macrocystic komponenter. Klikk her for å se en større versjon av figuren. </ P>
Noen forskere har antydet at lymfatiske misdannelser representerer en utviklingsforstyrrelse av lymfatisk blodkar der LMU ikke har unormal vekst potensial, men i stedet har ikke klart å koble til normal sirkulasjon 19. Vi har imidlertid funnet at LM LMUene spre seg hurtigere og er mer resistente mot apoptose enn skin LMUene 15 noe som tyder på at det er en primær defekt i LM LMUene. Når LM LMU er implantert i en mus xenograft modell, danner de strukturer som minner om lymfatiske misdannelser 15. Dette støtter en hypotese om at lymfatiske misdannelser kan være forårsaket av en eller flere somatiske mutasjoner som oppstår i LM LMUene under fosterutviklingen. Faktisk har de siste rapportene identifisert en slik mutasjon i p110α katalytisk subenhet av phosphoinositide-3-kinase (PIK3CA) genet 20.
Gitt de fremskritt i DNA sekvenseringsteknologi, relevante mutasjoner could bli lettere identifiseres i isolerte LM LMU, guiding fremtidige studier av disse forholdene. Isolering av levedyktige LMUene ville lette sammenligninger mellom unormale og normale LMU i analyser som migrasjon, spredning, rør forming evne og overlevelse i respons til redusert næringsstoffer eller pro-apoptotiske agenter 15. Isolerte LMU vil videre gjøre oss i stand til å utføre cellespesifikke genuttrykk og proteomikk studier, for å avgrense nye LMU subpopulasjoner og oppdage nye farmakologiske midler egnet for klinisk behandling av lymfatiske misdannelser.
Vi har tidligere publisert en LEC isolasjonsmetoden basert på magnetiske kuler separasjon av LMU fra neonatal forhuden og lymfatiske misdannelser 15. Vi har rapportert en strategi for å skille normale og syke LMUene fra vaskulære endotelceller basert på fravær av CD34 ekspresjon, fulgt ved å utsette CD34 Neg cellefraksjon til positiv utvelgelse for CD31.Imidlertid ble denne metoden hemmet av nærværet av gjenværende ikke-endotelceller. Dette var uavhengig av fjerning av epidermis før etterfølgende bindevev fordøyelse. Disse forurensninger generelt proliferert hurtigere og dermed til slutt overgrew endoteliale cellekulturene til tross for etterfølgende forsøk på å gjenta LEC isolasjon. Faktisk, en første forurensning av ikke-endotelceller så lavt som 2% til 5% var tilstrekkelig til å overvelde LEC populasjonen 15. Dette fikk oss til å utforske fluorescently aktivert celle sortering metode som et alternativ til å forbedre LEC celle yield og renhet. I tillegg brukte vi multi-parameter sortering for å øke spesifisiteten av LMU populasjoner, og legger VEGFR-3 og PODOPLANIN til valg markører for å identifisere CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LMU.
Begrunnelsen for å velge disse markørene var basert på rapporter som mens LMU og blod vaskulær endotelial cells har mange markører celleoverflate felles som CD31, LMU viser fenotypisk variasjon i deres uttrykk av CD34, PODOPLANIN og VEGFR-tre celleoverflaten markør i forhold til blod vaskulære endotelceller 21-23. CD31 er et 130 kDa glykoprotein trans også kjent som blodplater endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1). Det er ansett å være en pan-endotel-cellemarkør, siden det er uttrykt på alle typer av blod- og lymfekar 21,24,25. CD34 er 110 kDa-transmembran-glykoprotein som finnes på de fleste hematopoetiske progenitorceller og stamceller, vaskulære endotelceller, og noen lymfekar 26.
VEGFR-3, reseptoren for vaskulær endotelial vekstfaktorer C og D, er som opprinnelig var tilstede i utviklings årer i mus embryo, men etter lymfatisk spesifikasjon regulert av transkripsjonsfaktorer SRY messige HMG-boksen (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skuespiller 2 (COUPTF-II) og PROX-1, er VEGFR-3 venøs uttrykk tapt, og det blir begrenset til embryonale LMUene 25,27. PODOPLANIN, en 38 kDa membran mucoprotein, først bemerket på lymfekar på ca embryonale dag 11 (~ E11.0) av mus embryonale utvikling 28, og mens det er sterkt uttrykt av mikrovaskulære lymfekar, PODOPLANIN uttrykk ved macrocystic lymfatisk endotelet i lymfatiske misdannelser er mer variabel 15. Flowcytometri eksperimenter tyder på at i hvert fall noen CD34 Høy CD31 Pos endotelceller uttrykke lymfatiske markør PODOPLANIN 29. Selv om systematisk evaluering av LYVE-1 og PODOPLANIN farging i humane lymfatiske misdannelser viste at både er effektive ved beising lymfatisk endotel 30 misdannelse, i normalt vev, LYVE-1 ble rapportert å være sterkt til stede i den initiale lymfatiskekapillær endotel men reduseres og til og med fraværende i oppsamlings lymfatisk endotel 31. Som vår målsetting er å isolere både de første og samle lymfatiske endotelceller vi har valgt å ikke bruke LYVE-en som en del av vår celle utvalg strategi. Endelig beslutning om å ansette disse markørene var også basert på tilgjengeligheten av antistoffer som brukes diagnostisk for merking lymfekar for mikroskopisk bildebehandling, en funksjon som ville tillate sammenheng mellom flowcytometri og immunofluorescent studier.
Denne artikkelen vil beskrive vev fordøyelsen metoden, cellefarging og FACS innstillingene som kreves for vellykket isolering av CD34 lav CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LMU samt CD34 Høy CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller fra forhuden og lymfatisk malformasjon vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMUene spiller en viktig rolle i å opprettholde fluid homeostase, immunrespons mot fremmede antigener og absorpsjon og transport av enkelte næringsstoffer. LEC homeostase kan påvirkes av sykdomsprosesser slik som bakterielle infeksjoner og tumormetastase, men LMUene kan også utvikle somatiske mutasjoner som resulterer i dannelsen av dysfunksjonelle lymfekar og betydelig morbiditet for berørte pasienter. For å få mer forståelse av lymfatisk malformasjon etiologi gjennom in vivo implantasjon og ex viv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Baker Foundation og Det Kongelige Barnas Stiftelsens Kvinner i forskning Fellowship 'støtte av Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty og Edouard G. Stanley er NHMRC Senior stipendiater. Arbeid i sine laboratorier ble støttet av NHMRC og stamceller Australia.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. . Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
- . for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. . 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
