Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Summary

Цель этого протокола заключается в изоляции лимфатические эндотелиальные клетки, выстилающие человека лимфатическая киста порок, как сосуды и крайнюю плоть с помощью сортировки флуоресценции активированных клеток (FACS). После культивирования и расширение этих клеток клеток позволяет новый уровень сложности для экспериментальной генетических, протеомных, функциональных и дифференцировки клеток исследований.

Abstract

Лимфатические расстройства системы, такие как первичная лимфедема, лимфатических пороков и лимфатических опухолей редкие условия, которые вызывают значительную заболеваемость, но мало что известно об их биологии. Изоляция очень чистые человеческие лимфатические эндотелиальные клетки (МИК) от больных и здоровых тканей будет способствовать исследования лимфатической эндотелия у генетических, молекулярных и клеточных уровнях. Предполагается, что эти исследования могут выявить целевые показатели для новых методов лечения, которые могут изменить клиническую управление этими условиями. Протокол описания изоляции крайней плоти человека LEC, и лимфатической пороков развития лимфатических эндотелиальных клеток (LM) Lecs представлена. Для получения одного суспензии клеток ткани измельчают и ферментативно лечить с помощью диспазу II и коллагеназы II. В результате суспензию отдельных клеток, то помечены с антителами к кластер дифференцировки (CD) маркеров CD34, CD31, фактора роста эндотелия сосудов-3 (VEGFR-3) и PODOPLANIN. СтаиNED жизнеспособные клетки были отсортированы на флуоресцентно активированного клеточного сортера (FACS), чтобы отделить ^Поз PODOPLANIN ^Поз LM LEC население CD34 CD31 ^{низкий Поз} VEGFR-3 от других эндотелиальных и не-эндотелиальными клетками. Отсортированные LM МИК культивировали и расширил фибронектина покрытием колбы для дальнейшего экспериментального использования.

Introduction

Основная функция лимфатической сосудистой системы, чтобы поглотить лимфы, избыток тканевой жидкости, содержащей липиды, белки и клеточные компоненты, и вести его к системе венозной крови. Сеть лимфатических капилляров лимфа направляет в лимфатические узлы, где она проверяется на наличие чужеродных антигенов, важного процесса в иммунного надзора и развертывания белых кровяных клеток, чтобы нейтрализовать чужеродные антигены.

Однонаправленный лимфатическая система начинает в тканях с начальной лимфатической капиллярной, уникальной структурой с разрывным одного слоя тонкостенных плоских эндотелиальных клеток со специализированными переходов, которые позволяют клеток лимфы запись ^1,2. Эти капилляры прикреплены к соседней соединительной ткани матрицы с помощью анкерных нити, чтобы предотвратить разрушение сосудов в присутствии повышенного давления интерстициальной ^3. Начальные лимфатические капилляры впадают в лимфатические капилляры сборачто сливаются в более крупные лимфатические сосуды или вены. По сравнению с первоначальным лимфатические капиллярные сосуды, лимфатические сосуды сбора имеют более толстые стенки сосудов, в сочетании лимфатические клапаны и заключены разрывной базальной мембраны, в которой несколько клеток гладких мышц встроены ^4. Скоординированная открытие и закрытие клапанов лимфатических и сокращение гладкомышечных клеток способствует поток лимфы ^3. У человека, лимфатические вены из различных областей тела соединяются в лимфатические стволы, которые, сливаясь, образуют два лимфатических протоков: грудной проток и правый лимфатический проток. Грудной проток дренирует лимфу от левой стороны тела и с правой стороны под грудью, а правый лимфатический проток стоков лимфатических от правой руки и правой стороны головы, шеи, и грудной клетки. Оба каналы вести лимфы в подключичной вены на шее ^5.

Расстройства лимфатической системы широко сгруппированы в приобрелаго врожденными (Таблица 1). Примеры приобретенных условий лимфангит и вторичной лимфедемы. Лимфангит это воспаление лимфатического сосуда из-за бактериальной инфекции. Затронутые лимфатические расширяются и наполняются экссудата, содержащего полиморфноядерных клеток. В коже, эти лимфатические видны как красное, болезненное подкожной полосы часто сопровождается расширением соответствующей дренажной лимфатического узла (лимфаденита) ^6. Вторичный лимфедема возникает вследствие повреждения или обструкции в лимфатический сосуд или обструкции лимфатических узлов. Это приводит к хроническим прогрессирующим отеком из-за накопления лимфы дистальнее повреждения или обструкции. В развитых странах, среднее лимфедема чаще всего связаны со злокачественной опухолью, где метастазирующих опухоли препятствовать лимфатические сосуды или региональных лимфатических узлов, или как следствие противораковой терапии после хирургического удаления лимфатических узлов, после облучения фиброза и пост-воспалительных тромбофлебитbosis и рубцов ^7. В других частях мира, среднее лимфедема может быть вторичным по отношению к лимфатической обструкции, вызванной паразитическими червями, такие как Нитчатка Банкрофта ^6.

Нарушения лимфатической сосудистой системы
Приобретенный	Врожденный
Лимфаденит Вторичный лимфедема	Первичная лимфедема 10	Отдельные Лимфатические Пороки 13	Лимфатическая Пороки, связанные с синдромами 13
	например Милрой синдром Меж синдром	Простой: Лимфатические пороки	например Клиппеля-Tranaunay синдром Парки Вебер синдром Стердж-Вебера синдром
		Комбинированный: Капиллярные-лимфатической аномалии Капиллярная-лимфатической-венозных порок Капиллярная-лимфатической-артериовенозная мальформация Капиллярная-лимфатической венозного артериовенозная мальформация

Таблица 1. Обзор нарушений лимфатической сосудистой системы.

Врожденные нарушения лимфатической системы включают в себя первичный идиопатический () лимфедема думал, чтобы быть вызван генетическими мутациями, лимфангиэктазия и аномалий лимфатической системы ^8,9. Первичная лимфедема может быть спорадическим, вероятно, вызвано De Novo мутации, или по наследству. Лимфатические расстройства также могут быть изолированы или содержать часть более общей синдрома ^10. В педиатрической популяции, 97% лимфыотек носит спорадический характер с отклонениями в лимфатической структуры сосуда, которые препятствуют региональной лимфодренаж ^11. Болезнь Милрой является примером первичной лимфедема, вызванной мутацией в гене очевидным при рождении или вскоре после ¹² в VEGFR-3. Хотя в основном семейной состоянии, болезнь Милрой также могут быть определены в детей без семейной истории болезни Milroy ^32. Тяжесть любой лимфедема зависит от количества лимфы производства и способности транспортировать лимфу обратно венозного ^6.

На основании клинической картины и на месте пролиферации эндотелиальных клеток, аномалии лимфатической системы классифицируются как опухолей лимфатических тканей или лимфатических мальформаций ^13. Kaposiform lymphangiomatosis является примером LEC опухоли ^14. Лимфатические пороки, как полагают, возникают во время эмбрионального развития и растут пропорционально ребенка ^15,16. Они редко регрессируют, но может Remaiп бессимптомно до тех пор, травма или инфекция не выпадает быстрый рост, ведущий к клиническим осложнениям. Упорядоченную структуру лимфатической сети и проведения лимфы из тканей в венозное кровообращение, описанной выше возмущается в лимфатических пороков, которые состоят из локализованных коллекций аномальных кист структур, заполненных лимфатической жидкости. В то время как нет клинических или экспериментальных доказательств, что эти кистозные сосуды соединены лимфатической циркуляции, или что они содержат функциональные лимфатические клапаны, их лимфатической идентичность подтверждена путем экспрессии диапазоне лимфатических маркеров клеток, таких как PODOPLANIN, CD31, лимфатический сосуд эндотелиальных рецепторов 1 (LYVE-1), Просперо гомеобоксный белок 1 (PROX-1) и VEGFR-3 ^15,17,18. Эти кистозные структуры могут быть небольшой (microcystic) или большой (macrocystic), но большинство лимфатических пороки содержать как microcystic и macrocystic компоненты (рис 1) ^16. После операции, injectioп склеротерапия и / или радиочастотная абляция лимфатические пороки часто повторяться.

Рисунок 1. Морфология лимфатических сосудов и лимфатических человека пороков развития. Нормальный человек лимфатической () и лимфатические сосуды пороков (B и C), меченные антитела PODOPLANIN (коричневый этикетка, стрелка). Человека лимфатические сосуды пороков характеризуется выраженной дилатации и значительном изменении размера просвета. Эти локализованные аномальные кистозные структуры могут быть небольшой (microcystic, *) (В) или большие (macrocystic, #) (С). Большинство лимфатических пороки содержать как microcystic и macrocystic компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке. </ P>

Некоторые исследователи предположили, что лимфатические мальформации представляют собой нарушение развития из лимфатических сосудов, в которых МИК не имеют аномальные потенциал роста, но вместо этого не смогли подключиться к нормальной циркуляции ^19. Тем не менее, мы обнаружили, что LM МИК пролиферируют быстрее и более устойчивы к апоптозу, чем плоть МИК ¹⁵ что свидетельствует о наличии первичного дефекта в LM МИК. Когда LM МИК имплантируются в мышиной модели ксенотрансплантата, они образуют структуры, напоминающие лимфатических пороков ^15. Это подтверждает гипотезу о том, лимфатические мальформации может быть вызвано одной или более соматических мутаций, возникающих в LM МИК во время развития плода. Действительно, последние отчеты выявили одну такую ​​мутацию в p110α каталитической субъединицы фосфоинозитидного-3-киназы (PIK3CA) гена ^20.

Учитывая достижения в секвенирования ДНК технологии, соответствующие мутации грУальд быть более легко идентифицировать в изолированных LM МИК, направляя будущие исследования этих условиях. Изоляция жизнеспособных МИК бы облегчить сравнение между аномальными и нормальными LEC, в анализах, таких как миграция, распространение, способность трубы формирования и выживания в ответ на снижение доступности питательных веществ или проапоптотических агентов ^15. Изолированные МИК далее позволило бы нам выполнить экспрессию гена соты и протеомические исследования, чтобы очертить новые LEC субпопуляции и открыть новые фармакологические агенты, пригодные для клинического управления лимфатических пороков развития.

Ранее мы опубликовали LEC метод изоляции на основе магнитной сепарации бусинок МИК от неонатальной крайней плоти и лимфатических пороков ^15. Мы сообщали о стратегии разделения нормальных и пораженных Lecs из сосудистых эндотелиальных клеток, основанных на отсутствие экспрессии CD34, после чего подвергают клеточной фракции CD34 ^{Отрицательное} положительного отбора CD31.Тем не менее, этот метод был затруднен из-за наличия остаточных без эндотелиальных клеток. Это не зависит от удаления эпидермиса до последующего соединительной ткани пищеварения. Эти загрязняющие вещества, как правило распространились быстрее и, таким образом, в конечном итоге переросла в эндотелиальных клеточных культур, несмотря на последующие попытки повторить изоляции LEC. Действительно, начальное загрязнение без эндотелиальных клеток, как низко как 2% до 5% было достаточно, чтобы подавить LEC население ^15. Это побудило нас исследовать флуоресцентно активированной метод сортировки клеток в качестве опции для улучшения LEC выход клеток и чистоту. Кроме того, мы использовали мульти-параметр сортировки для повышения специфичности LEC населения, добавив, VEGFR-3 и PODOPLANIN маркерам отбора для выявления CD34 CD31 ^{низкий поз} VEGFR-3 ^поз PODOPLANIN ^поз Lecs.

Основанием для выбора этих маркеров на основе докладов, которые в то время МИК и кровеносная эндотелия CEзаполняет много маркеры клеточной поверхности общие, такие как CD31, МИК показать фенотипическую вариацию в их выражения CD34, PODOPLANIN и VEGFR-3 клеточной поверхности маркера по сравнению с кровью сосудистых эндотелиальных клеток ^21-23. CD31 представляет собой 130 кДа трансмембранный гликопротеин также известный как тромбоцитов молекулы клеточной адгезии эндотелиальных 1 (РЕСАМ-1). Это считается пан-эндотелиального маркера клеток, поскольку он экспрессируется на всех типах кровеносных и лимфатических сосудов ^21,24,25. CD34 110 кДа трансмембранный гликопротеин присутствует на самых гемопоэтических предшественников и стволовых клеток, сосудистые эндотелиальные клетки и некоторые лимфатические сосуды ^26.

VEGFR-3, рецептор для роста сосудистого эндотелия факторы С и D, изначально присутствующих на развивающихся вен у эмбрионов мыши, но после лимфатической спецификации регулируемой факторов транскрипции SRY связанную HMG-бокс (SOx) -18, C Hicken О valbumin у pstreaм р romoter т ranscription е актер 2 (COUPTF-II), и PROX-1, VEGFR-3 венозная выражение теряется и становится ограниченной эмбрионального МИК ^25,27. PODOPLANIN, 38 кДа мембрана мукопротеина, сначала отметил на лимфатические сосуды примерно эмбриональных 11 день (~ E11.0) мышиного эмбрионального развития ²⁸ и в то время он сильно выражена микрососудистых лимфатических сосудов, PODOPLANIN выражения по macrocystic лимфатической эндотелия в лимфатических пороков более ¹⁵ Переменная. Проточной цитометрии эксперименты показывают, что по крайней мере некоторые CD34 CD31 ^{высокий Pos} эндотелиальные клетки выразить лимфатическую маркер PODOPLANIN ^29. Хотя систематическая оценка LYVE-1 и PODOPLANIN окрашивания в лимфатических пороков человека показали, что оба являются эффективными в окрашивания лимфатическую порок эндотелий ^30, в нормальных тканях, LYVE-1, как сообщается, настоятельно присутствует в начальной лимфатическойэндотелия капилляров, но снижается и даже отсутствуют в коллекторной лимфатической эндотелия ^31. Поскольку наша цель состоит в том, чтобы изолировать и начальные и сбор лимфатические эндотелиальные клетки, мы решили не использовать LYVE-1, как часть нашей стратегии отбора клеток. Наконец, решение использовать эти маркеры была также основана на наличии антител, которые используются для маркировки диагностически лимфатические сосуды для микроскопических изображений, особенность, которая позволила бы корреляцию между проточной цитометрии и иммунофлуоресцентных исследований.

Эта статья будет описывать метод ткани пищеварения, окрашивание клеток и настройки FACS, необходимое для успешного выделения CD34 CD31 ^{низкий Поз} VEGFR-3 ^{Pos Pos} PODOPLANIN LEC, а также CD34 CD31 ^{высокий Поз} рецептор-3 ^Поз PODOPLANIN ^Pos эндотелиальных клеток из плоти и лимфатической пороков ткань.

Protocol

Этика заявление: Этическое одобрение коллекции лимфатических пороков развития и крайней плоти тканей была получена из комитетов по этике научных исследований человека в Королевской детской больницы в Мельбурне, Австралия. Подписано согласие было получено от родителей пациентов до о…

Representative Results

После первоначального ткани пищеварения, после 24 часов в культуре нефракционированного образцов, отдельные колонии эндотелиальных клеток может наблюдаться (фиг.2А) вместе с фибробластоподобных клеток и клеток гладкой мускулатуры. После сортировки и после 24 часов в культуре ?…

Discussion

МИК играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, иммунный ответ на чужеродные антигены и поглощения и транспорта некоторых питательных веществ. LEC гомеостаз могут быть затронуты болезненные процессы, такие как бактериальные инфекции и метастазов опухоли, но МИК может развив?…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalogue Number	Description
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution