갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징
Summary
Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Abstract
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
Introduction
신장은 다양한 물질에 대한 항상성 균형을 유지하고 전체의 혈압을 결정하는 방식으로 혈액량을 조절한다. 하이퍼 또는 저혈압에 이르기까지의 신장의 여과, 재 흡수 또는 분비 리드의 장애 또는 동반 병적 인 상태는, 결국 신장 이식을 필요로 무대 신장 질환을 종료합니다. 모세 혈관 내피, 기저막 및 상피 세포의 단세포 층 – – 슬릿 다이어프램 무결성 및 기능 (1)의 유지에 중요한 역할을 족 세포, 신장 필터링 부 (사구체)은 3 개의 층으로 이루어져있다. 투과성 사구체 필터 부전은 단백뇨와 같은 거대 분자의 소변 손실이 발생합니다. 각종 제제는 사구체 여과 장벽의 완전성을 결정 족 세포 및 그들의 발 프로세스의 구조에 영향을 미칠 수있다.
족 세포는 glom의 유지에 관여eruli 여과 기능. 이는 발 세포 부적절한 칼슘 처리가 세포 손상에 이르게하고 병증 2,3- 다양한 형태의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 확립되어있다. 따라서, 발 세포의 기능 연구를위한 수단이 될 것입니다 세포 내 칼슘 농도의 변화를 직접 측정 가능하게하는 모델의 개발. 격리 사구체 이전 알부민 반사 계수의 측정 (4) 및 전체 셀 전기 생리 패치 – 클램프 측정 5,6-에서 적분 셀룰러 전류의 평가를 변경 포함한 수많은 연구에 사용 하였다. 본 논문에서는, 약학 제제의 적용에 응답하여 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 세포 내 칼슘의 기저 레벨을 추정하고, 개별 칼슘 채널의 활성을 평가하기 위해 연구를 허용하는 프로토콜을 기술한다. Ratometric 칼슘 농도 측정 및 패치 클램프 electrophysiology 각각 발 세포 및 채널 활동 내에서 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하는데 사용 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 방법은 설치류 사구체의 족 세포에 의한 칼슘 처리의 분석을 위해 수 있습니다. 이 기술은 패치 클램프 단일 채널 전기 생리학 및 형광 비율 계량 공 초점 영상의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 그러나, 두 방식은 자신에, 별도로 사용할 수있다. 제안 된 프로토콜은 1) 신장 플러시 등 여러 상대적으로 간단한 단계를 가지고있다; 2) 차동 체질에 의한 사구체의 분리; 3) 패치 클램프…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트, Inc.에) 감사의 말씀을 전합니다. 그레고리 블라스는 원고의 중요한 교정을 인정한다. 이 연구는 (AS에) 1-15-BS-172 및 DVI (에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동을 부여 건강 보조금 HL108880 및 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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