podocytes 내 세포 내 칼슘 수치의 변화는 사구체의 여과 기능을 제어하는 가장 중요한 수단 중 하나입니다. 여기에서는 갓 분리된 사구체의 podocytes에서 실시간 칼슘 처리 및 단일 이온 채널 활성을 검출할 수 있는 high-throughput 접근법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Podocytes (신장 사구체 상피 세포)는 사구체 투과성을 조절하고 사구체 구조를 유지하는 것으로 알려져 있습니다. podocyte 손상이 단백뇨와 발 과정 소실로 이어지기 때문에 다양한 신장 질환의 발병기전에서 이러한 세포의 중요한 역할이 확립되었습니다. 이전에 다양한 내인성 물질이 podocytes의 세포 내 Ca2+ 농도에 극적인 과부하를 일으켜 알부민뇨를 유발할 수 있다고 보고되었으며, 이는 칼슘 전도성 이온 채널을 통해 발생할 가능성이 높습니다. 그러므로, 정상적인 조건과 다양한 병리학적 상태 모두에서 podocytes의 칼슘 취급을 연구하는 것이 중요해 보였습니다. 그러나 사용 가능한 실험적 접근 방식은 배양 및 형질 주입된 세포에 다소 제한되어 있습니다. 그것들은 그러한 연구를 위한 좋은 기본 모델을 나타내지만, 본질적으로 사구체의 고유 환경에서 추출됩니다. 여기에서 우리는 갓 분리된 전체 사구체의 일부로 podocytes를 연구하는 방법론을 설명합니다. 이 제제는 여전히 모세혈관에 붙어있는 podocytes의 기능적 잠재력을 유지합니다. 따라서 podocytes는 사구체 여과 장치의 주요 부분을 보존하는 환경에 남아 있습니다. 본 원고는 1) 비율계량 공초점 형광 현미경의 도움으로 칼슘 농도 변화를 실시간으로 감지하고 2) 갓 분리된 사구체의 podocytes에서 단일 이온 채널 활성을 기록할 수 있는 두 가지 실험적 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이러한 방법론은 사구체의 고유 환경의 장점을 활용하여 연구자가 다양한 제제의 적용에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 처리의 급격한 변화를 해결하고, 세포 내 칼슘의 기초 농도를 측정하고(예: 질병 진행 평가를 위해), 단일 이온 채널 수준에서 칼슘 전도도를 평가 및 조작할 수 있습니다.
서론
신장은 다양한 물질에 대한 항상성 균형을 유지하고 전체의 혈압을 결정하는 방식으로 혈액량을 조절한다. 하이퍼 또는 저혈압에 이르기까지의 신장의 여과, 재 흡수 또는 분비 리드의 장애 또는 동반 병적 인 상태는, 결국 신장 이식을 필요로 무대 신장 질환을 종료합니다. 모세 혈관 내피, 기저막 및 상피 세포의 단세포 층 - - 슬릿 다이어프램 무결성 및 기능 (1)의 유지에 중요한 역할을 족 세포, 신장 필터링 부 (사구체)은 3 개의 층으로 이루어져있다. 투과성 사구체 필터 부전은 단백뇨와 같은 거대 분자의 소변 손실이 발생합니다. 각종 제제는 사구체 여과 장벽의 완전성을 결정 족 세포 및 그들의 발 프로세스의 구조에 영향을 미칠 수있다.
족 세포는 glom의 유지에 관여eruli 여과 기능. 이는 발 세포 부적절한 칼슘 처리가 세포 손상에 이르게하고 병증 2,3- 다양한 형태의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 확립되어있다. 따라서, 발 세포의 기능 연구를위한 수단이 될 것입니다 세포 내 칼슘 농도의 변화를 직접 측정 가능하게하는 모델의 개발. 격리 사구체 이전 알부민 반사 계수의 측정 (4) 및 전체 셀 전기 생리 패치 - 클램프 측정 5,6-에서 적분 셀룰러 ....
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프로토콜
동물 사용 및 복지 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 프로토콜 다음과 같은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수해야합니다.
1. 신장 세척
- (그러나 다른 연령과 성별의 다른 균주에 따라 변경 사용할 수 있습니다, 스프 라그 돌리 변형이 제안) 8-12주 세 남성 쥐를 사용합니다.
- IACUC 프로토콜에 의해 허용 된 절차에 따라 동물을 마취; 마취 깊이를 모니터링하고 동물을 검사한다. 수술의 상세한 설명은 1.3에서 수행되는 - 1.8 Ilatovskaya 외에서 찾을 수있다 (7).
- 적절한 마취 후, 온도 조절 수술 테이블에 동물을 배치 (최대 길이 3 인치) 복부의 정중선 절개를하고, 대정맥과 대동맥을 발견.
- 복강 및 상 장간막 동맥과 복부 주위에 합자를 삽입그 위의 대동맥; 결찰하지 않습니다.
- 신장 동맥 아래 복부 대동맥을 해부하고, 주위에 두 개의 합자를 배치하지만, 결찰하지 않는 무딘, 다음 합자 위의 대동맥을 고정하고 밑실 넥타이.
- 클램프 아래 (PBS로 가득 주사기 펌프에 부착) 폴리에틸렌 PE50 튜브와 대동맥을 카테 테르를 꽂다 두 ....
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결과
여기에서는 족 세포에서 칼슘 농도 급성 변화를 측정하는 문제를 해결. 1 갓의 족 세포에서 고해상도 실시간 형광 공 초점 이미지 및 단일 이온 채널 활성 레코딩을 수행하기 위해 설계된 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다 고립 된 쥐 사구체. 쥐를 마취 한 후 간단히, 신장은 피를 취소 PBS로 플러시해야합니다. 그런 다음, 신장 절제와 디 캡슐화하고, 사구체는 차동 체질에 의한 신장 피질에서 분리되어 있습니다. 시료의 일부는 패치 - 클램프 분석을 위해 취해질 수 있으며, 나머지는 형광성 칼슘 염료 FLUO-4 AM과의 Fura 레드로드 될 수 있고, 공 초점 비율 적 칼슘 이미징을 수행하기 위해 AM.
단일 이온 채널 활성의 측정은 전기 생리 사구체 차단 후 즉시 수행 될 수있다. 이온 차의 활동nnels 패치 - 클램프 방법의 세포 부착 및 전체 셀 구성에서 모두 측정 할 수있다. 도시 된 접근법의 타당성을 입증하.......
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토론
여기에 설명 된 방법은 설치류 사구체의 족 세포에 의한 칼슘 처리의 분석을 위해 수 있습니다. 이 기술은 패치 클램프 단일 채널 전기 생리학 및 형광 비율 계량 공 초점 영상의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 그러나, 두 방식은 자신에, 별도로 사용할 수있다. 제안 된 프로토콜은 1) 신장 플러시 등 여러 상대적으로 간단한 단계를 가지고있다; 2) 차동 체질에 의한 사구체의 분리; 3) 패치 클램프 전기 생리학 실험을 수행, 또는 세포 내 칼슘의 변화의 비율 계량 공 촛점 이미징을위한 형광 칼슘 라벨 염료와 사구체의 배양.
사구체 Gloy에 기초하여 수정 된 프로토콜을 분리하려면 외. (5)를 사용 하였다. 차동 체질의 현재 기술의 주요 장점은 복잡하고 시간 소모적 인 단계를 필요로하지 않는, 따라서 보우만 캡슐 스트리핑 사구체 발생하고 있다는수동 캡슐화의. 격리 된 부분에서 사구체의 대부분이 디 캡슐 레이트, 그러나 연구원도 캡슐화 사구.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트, Inc.에) 감사의 말씀을 전합니다. 그레고리 블라스는 원고의 중요한 교정을 인정한다. 이 연구는 (AS에) 1-15-BS-172 및 DVI (에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동을 부여 건강 보조금 HL108880 및 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | DMSO 내 500 µl |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | 용액 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| 튜브 회전기 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | 독일 |
| Nikon 공초점 현미경 (도립형) | Nikon | Nikon A1R | 레이저 여기 488 nm. 방출 필터 500-550 nm 및 570-620 nm |
| 대물렌즈 | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| 커버 글라스 | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| 고진공 그리스 | Dow Corning | 실리콘 화합물 | |
| 소프트웨어 | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| 기록/관류 챔버 | Warner Instruments | RC-26 | |
| 패치 클램프 증폭기 | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| 데이터 획득 시스템 | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® 시스템 |
| 저역 통과 필터 | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| 붕규산 유리 모세관 | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Co | P-97 | 화염/Brown 방식 마이크로피펫 풀러 |
| 마이크로포지 | Narishige | MF-830 | 일본 |
| 전동 마이크로매니퓰레이터 | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| 도립 현미경 | Nikon | Eclipse Ti | |
| 미세진동 격리 테이블 | TMC | 패러데이 케이지 장착 | |
| 다채널 밸브 관류 시스템 | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| 기록/관류 챔버 | Warner Instruments | RC-26 | |
| 소프트웨어 | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | 항생제 제외 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% 알부민 용액 |
| 온도 조절 수술대 | MCW core | 설치류용 | |
| 강철 체 | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | CD-1용 스크린 |
| 쌍안 현미경 | Nikon | Eclipse TS100 | |
| 쌍안 현미경 | Nikon | SMZ745 | |
| 주입 펌프 기반 관류 시스템 | Harvard Apparatus | ||
| 폴리에틸렌 튜브 | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane 마취기 |  VetEquip, Inc. | 911103 | |
| 기타 기본 시약 | Sigma-Aldrich |
참고문헌
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of pro....
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