Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
Почки поддержания гомеостаза баланс для различных веществ и регулируют объем крови таким образом, что определяет общую кровяное давление. Нарушения в почечной фильтрации, реабсорбции или секреции приводят к или сопровождают патологические состояния, начиная от гипер- или гипотензии, чтобы терминальной стадией почечной недостаточности, что в конечном итоге требует трансплантации почки. Почечная блок фильтрации (клубочек) состоит из трех слоев – капиллярный эндотелий, базальной мембраны и одного слоя клеток эпителиальных клеток – подоцитов, которые играют важную роль в поддержании щелевой диафрагмой целостности и функции 1. Дисфункция в полупроницаемую клубочковой фильтра вызывает недержание потери макромолекул, таких как протеинурия. Различные агенты могут повлиять на структуру подоцитов и их процессов стопы, которые определяют целостность клубочки фильтрационного барьера.
Подоцитов участвуют в поддержании гломеeruli функция фильтрации. Было установлено, что неправильное обращение кальция в подоцита приводит к повреждения клеток и играет важную роль в прогрессировании различных форм нефропатии 2,3. Таким образом, разработка модели, которая позволяет для прямого измерения внутриклеточных изменений концентрации кальция будет способствовать для изучения функции подоцитов. Изолированные клубочки ранее использовались в течение многих исследований, включая измерения альбумина коэффициента отражения изменения 4 и оценку интегральных клеточных токов в электрофизиологических измерений 5,6 патч-зажим цельноклеточных. В настоящей работе мы описываем протокол, который позволяет исследователю измерять внутриклеточные изменения концентрации кальция в ответ на применения фармакологических агентов, оценить уровень базальной кальция внутри клеток, а также оценить деятельность индивидуального кальциевых каналов. Ratometric измерения концентрации кальция и патч-зажим electrophysiology были использованы для определения изменения внутриклеточной концентрации кальция внутри подоцита и канала активности, соответственно.
Описанный здесь подход позволяет проводить анализ обработки кальция подоцитов грызуна клубочков. Этот метод позволяет применение патч-зажим электрофизиологии одного канала и флуоресценции пропорциональный конфокальной микроскопии. Тем не менее, оба подхода могут быть использованы…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Григорий Бласс признается критического корректуры рукописи. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья грантов HL108880 и Американской Диабетической Ассоциации предоставить 1-15-BS-172 (как), и Бен J. Липс исследовательский грант от Американского общества нефрологии (для DVI).
Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
TEA chloride | Tocris | T2265 | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |