Malet Tissue i Compressed Kollagen: en cell som innehåller BioTransplant för enkel iscensatt rekonstruktiv Repair

Summary

Vävnadsteknik inkluderar ofta in vitro expansion i syfte att skapa autotransplantat för vävnadsregenerering. I denna studie en metod för vävnadsexpansion, regenerering, och återuppbyggnad in vivo utvecklades för att minimera behandlingen av celler och biologiska material utanför kroppen.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

De flesta vävnadstekniska studier transplantation till huden och urogenitalsystemet inkluderar autologa cell skördar från frisk vävnad och cellexpansion i specialutrustade cell odling anläggningar ^1,2.

Efter cellexpansion, cellerna vanligtvis lagras för senare användning när patienten är beredd att ta emot den kroppsegna. Kväve frysar tillåta långvarig lagring vid låga temperaturer av -150 ° C eller lägre. Processen för frysning måste vara försiktig och kontrollerad för att inte förlora cellerna. En risk av celldöd är kristallisation av intracellulärt vatten under upptiningsprocessen, vilket kan leda till brott på cellmembranen. Cell frysning utförs vanligtvis genom långsam och kontrollerad kylning (-1 ° C per min), med användning av en hög koncentration av celler, fetalt bovinserum, och dimetylsulfoxid. Efter upptining av cellerna behöver bearbetas på nytt genom att ta bort frysmedium och odling på cellodlings plast eller enbiomaterial innan transplantation tillbaka till patienten.

Alla de ovan nämnda stegen är tidskrävande, arbetskrävande och kostsamma ^3. Dessutom, alla in vitro-behandling av celler avsedda för patient transplantation är starkt reglerad och kräver välutbildad och ackrediterade personal och laboratorier ^4. Allt som allt, att anskaffa en säker och tillförlitlig tillverkningsprocess, tekniken kan endast fastställas i ett mycket litet antal tekniskt avancerade centra och en bredare användning i vanliga kirurgiska sjukdomar är tveksamt.

I syfte att övervinna begränsningarna hos cellodling i laboratoriemiljön, är konceptet med att transplantera malda vävnaden för cell expansionen in vivo infördes genom att använda kroppen själv som en bioreaktor. För dessa ändamål, skulle auto företrädesvis att transplanteras på en 3D-form enligt den form som behövs för den slutliga rekonstruktionen av organ intresset ^5-7.

Ursprungligen var tanken att transplantera malet epitel presenteras av Meek 1958 när han beskrev hur epitel växer från kanterna av ett sår. Han visade att en liten bit hud skulle öka sina marginaler och därmed dess potential för expansion cell med 100% genom att skära bit två gånger i vinkelräta riktningar (Figur 1) ^8. Teorin har fått stöd genom användning av nät med partiell tjocklek hudtransplantation för hudtransplantation ⁹ och i huden sårläkningsmodeller ^10.

Figur 1:. Meek teori Enligt Meek teori, växer epitel från kanterna av ett sår. Genom att öka området exponeras av malningen teknik, epithelializes malet vävnad sår från många platser.

Den aktuella studien är baserad på hypotesen att samma princip skulle kunna tillämpas på den subkutana vävnaden genom att placera malet epitel runt en form. Epitelcellerna skulle mobilisera från malet transplantationer (omorganisera), täcker de lindade områden (migrerar) och dividera (expandera) i syfte att bilda en kontinuerlig neoepithelium som täcker sårområdet och separerar det främmande föremålet (formen) från den inre kroppen ( Figur 2).

Figur 2:. Tecknad av en 3D-form med malet epitel för in vivo intrakorporeal expansions vävnad enligt teorin om Meek Genom att använda malda vävnaden placeras på en form och därefter transplanteras till den subkutana vävnaden, är hypotesen att epitelcellerna migrera från kanterna av den malda vävnaden, omorganisera, och expandera för att bilda en kontinuerlig neoepithelium som täcker sårområdet och separerar det främmande föremålet (formen) från den inre kroppen.

Även tidigare in vivo-studier visar lovande resultat, kan ytterligare förbättringar uppnås genom att förstärka de auto så att regenere epitel kunde motstå mekanisk trauma bättre ^7. För dessa ändamål, var viktiga förutsättningar för en framgångsrik biomaterial identifierats, såsom: enkel diffusion av näringsämnen och avfallsprodukter, möjlighet att mögel i en 3D sätt och enkelheten i kirurgisk behandling. Slutsatser gjordes att dessa behov kan tillgodoses genom att lägga till en sammansatt biomaterial till malet vävnaden.

Den aktuella studien syftar till att utveckla en byggnadsställning som består av malet vävnad i plast-komprimerade kollagen innehållande en förstärkande kärna av en biologiskt nedbrytbar tyg. På detta sätt kan livskraftiga celler migrera från malet vävnadspartiklar och föröka sig med morfologiska egenskaper som kännetecknar den ursprungliga epitel (hud eller urothelium). Med hjälp av plast kompression, ställningen var att minskad i storlek från 1 cm till omkring 420 um som det malda partiklarna var innesluten i det övre skiktet kollagen. Stomfilten kan vara vilken som helst polymer men behöver modifieras med en hydrofil yta i syfte att koppla samman med de täckande kollagenskikt ^11.

Metoden gav en förbättrad ställnings integritet genom att införliva en stickad mesh bestående av poly (ε-kaprolakton) (PCL) inom två plast komprimerad kollagengeler använder den som en byggnadsställning för odling malet blåsan slemhinnan eller malet hud från svin. Konstruktet bibehölls i cellodlingsbetingelser i upp till 6 veckor in vitro, vilket demonstrerar framgångsrik bildning av en skiktad, flerskiktad urotelium eller skvamöst huden epitelet på toppen av en väl konsoliderad hybrid konstrukt. Konstruktionen var lätta att hantera och kan sys på plats för blås augmentation ändamål eller beläggning av skalet. Alla delar av vävnadsbyggnadsställning är FDA-godkända och teknikenskulle kunna användas för förfaranden enstegs genom vävnadsskörd, mals, plast kompression, och transplantera tillbaka till patienten som en enda-iscensatt ingripande. Det förfarande skulle kunna utföras för expansion vävnad och rekonstruktion under sterila betingelser i någon allmän kirurgi enhet.

Protocol

Alla djurprotokoll var i förväg godkänts av Stockholms läns kommittén på djur och alla förfaranden överensstämde med reglerna för djuranvändning, samt relevanta federala lagar. 1. djurförsök Förbereda djur för kirurgi Förbered operationsbordet med alla material och instrument som behövs för verksamheten under sterila förhållanden. Utföra operationen uteslutande under sterila förhållanden för att minska risken för infektion och optimera förhållan…

Representative Results

Denna studie presenterar en metod som visar hur man kan producera ett biomaterial för transplantation med användning av plast komprimering av kollagen och malda vävnaden. Bladder slemhinna och hud kan skördas och sedan mekaniskt malet i små partiklar (Figur 3). Genom plastisk komprimering, är det malda partiklar inkorporeras inuti kompositbyggnadsställning består av en centralt placerad bionedbrytbar polymer som är mekaniskt stark inom ytterskikt av en kollagengel <…

Discussion

Denna studie presenteras en enkel att använda tillvägagångssättet för att producera blåsväggen fläckar med autolog vävnad för transplantation vid operationsbordet. Plåstren är bildade genom kombinationen av en biologiskt nedbrytbar polymer stickning i mitten och kollagen med och utan malda vävnaden i de yttre ytorna i kombination med plast komprimering. Plast komprimering är en metod som tidigare beskrivits av andra författare och kan definieras som en snabb utdrivning av vätska från kollagengeler ^…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3