Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Summary

Tissue Engineering umfasst oft in vitro-Expansion um Autotransplantate für die Geweberegeneration zu erstellen. In dieser Studie wurde ein Verfahren zur Gewebeexpansion, Regeneration, Rekonstruktion und in vivo wurde entwickelt, um die Verarbeitung von Zellen und biologischen Materialien außerhalb des Körpers zu minimieren.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

Die meisten Tissue Engineering Studien über Transplantation auf die Haut und Urogenitaltrakt umfassen autologe Zell Ernten von gesundem Gewebe und Zellexpansion in speziell ausgestatteten Zellkultivieranlagen ^1,2.

Nach Zellexpansion werden die Zellen in der Regel für die spätere Verwendung gespeichert, wenn der Patient wird nach dem Autotransplantat zu erhalten. Stickstoffgefriergeräte erlauben die langfristige Lagerung bei niedrigen Temperaturen von -150 ° C oder niedriger. Der Prozess des Einfrierens muss, um vorsichtig und kontrolliert werden die Zellen nicht zu verlieren. Ein Risiko von Zelltod ist die Kristallisation des intrazellulären Wassers während des Auftauens Verfahren, die zum Bruch der Zellmembranen führen kann. Zelle Einfrieren wird üblicherweise durch langsame und kontrollierte Kühlung (-1 ° C pro min) unter Verwendung einer hohen Konzentration an Zellen, fötales Rinderserum und Dimethylsulfoxid durchgeführt. Nach dem Auftauen müssen die Zellen erneut verarbeitet werden, indem das Einfriermedium entfernt und das Kultivieren auf Zellkultur-Kunststoff oder einemBiomaterial vor der Transplantation zurück zum Patienten.

All die oben genannten Schritte sind zeitaufwendig, mühsam und teuer ^3. Darüber hinaus sind alle in vitro-Verarbeitung von Zellen für Patienten Transplantation bestimmte sind hoch reguliert und erfordert gut ausgebildete und akkreditierte Personal und Labors ^4. Alles in allem eine sichere und zuverlässige Fertigungsprozess zu beschaffen, könnte die Technik nur in einer sehr kleinen Zahl von technisch fortschrittlichen Zentren und eine breitere Nutzung gemeinsam chirurgischen Erkrankungen festgestellt werden, ist zweifelhaft.

Um die Grenzen der Zellkultivierung in der Laborumgebung zu überwinden, das Konzept der zerkleinerte Gewebe für Zellexpansion Transplantation in vivo wird unter Verwendung der Körper selbst als Bioreaktor eingeführt. Zu diesem Zweck würde die Autotransplantate vorzugsweise auf einem 3D-Form transplantiert werden entsprechend der Form, die für die endgültige Rekonstruktion der Organ i benötigt wird,nterest ^5-7.

Ursprünglich wurde 1958 von Meek präsentierte die Idee gehackt Epithel der Transplantation, als er beschrieb, wie Epithel von den Rändern der Wunde wächst. Er zeigte, dass ein kleines Stück Haut ihre Margen erhöhen und damit ihr Potenzial für die Zellexpansion von 100% durch das Stück zweimal in senkrechten Richtungen Schneiden (Abbildung 1) ^8. Die Theorie wurde durch die Verwendung von vermaschten Teilhauttransplantate für die Hauttransplantation ^{9 und} in der Haut unterstützt gewickelt Modelle ¹⁰ zu heilen.

Abb. 1: Meek Theorie, nach Meek Theorie wächst Epithel von den Kanten einer Wunde. Durch das Gebiet zu erhöhen, indem die Hacken Technik ausgesetzt, zerkleinerte Gewebe epithelializes Wunden von vielen Stellen.

Die vorliegende Studie ist auf der hypo BasisThese, dass das gleiche Prinzip, indem fein zerkleinert Epithel um eine Form zu dem subkutanen Gewebe angewendet werden kann. Die Epithelzellen würde aus gehacktem Transplantationen mobilisieren (reorganisieren) decken die Wundflächen (migrieren) und teilen (expand), um eine kontinuierliche neoepithelium zu bilden, die den Wundbereich abdeckt und trennt den Fremdkörper (die Form) von der Innenkörper ( Abbildung 2).

Abb. 2: Karikatur eines 3D-Form mit gehacktem Epithel für in vivo intrakorporalen Gewebeexpansion nach der Theorie von Meek von zerkleinerten Gewebes auf eine Form gebracht und anschließend auf das Unterhautgewebe transplantiert, ist die Hypothese, dass die Epithelzellen aus der Migration Kanten des Gewebes fein zerkleinert, reorganisieren und zu erweitern, um einen kontinuierlichen neoepithelium zu bilden, die den Fremdkörper (die Form) aus dem Innenkörper den Wundbereich und trennt abdeckt.

Obwohl frühere Studien in vivo viel versprechende Ergebnisse zeigen, konnte eine weitere Verbesserung, indem die Autotransplantate Verstärkung erreicht werden, so dass das regenerierte Epithel bessere mechanische Trauma ⁷ widerstehen konnte. einfache Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten, die Möglichkeit zu Schimmel in einer 3D-Form und Einfachheit der chirurgischen Behandlung: Für diese Zwecke wurden wichtige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Biomaterial, wie identifiziert. Schlussfolgerungen wurden gemacht, daß dieser Bedarf durch Zugabe eines zusammengesetzten Biomaterial Das zerkleinerte Gewebe erfüllt werden konnten.

Die aktuelle Studie zur Entwicklung eines Gerüsts an zerkleinertem Gewebe in Kunststoff-Druck Kollagen enthält einen Verstärkungskern aus einem biologisch abbaubaren Stoff zusammengesetzt ausgerichtet. Durch diese Mittel können lebensfähige Zellen von den zerkleinerten Gewebeteilchen migrieren und mit morphologischen charakteristischen Merkmale des Original Epithel (Haut oder Urothel) vermehren. Mit Kunststoff-Kompression, war das Gerüst reduzierend in der Größe von 1 cm bis etwa 420 & mgr; m als den zerkleinerten Teilchen wurden in der oberen Schicht Kollagen eingeschlossen. Die Kerngewebe könnte irgendein Polymer sein, muss aber mit einer hydrophilen Oberfläche, um mit der Abdeckung Kollagenschichten ¹¹ miteinander zu verbinden modifiziert werden.

Das Verfahren vorgesehen, eine verbesserte Gerüst Integrität durch ein gestricktes Netz, bestehend aus Poly Einbeziehung (ε-caprolacton) (PCL) innerhalb von zwei Kunststoffdruck Collagengele es als Gerüst verwendet für die Kultivierung von gehackten Blasenschleimhaut oder gehackt Haut von Schweinen. Das Konstrukt wurde in Zellkulturbedingungen gehalten bis zu 6 Wochen in vitro, erfolgreiche Bildung einer geschichteten, mehrlagigen Urothel oder Plattenepithelkarzinom Hautepithel auf der Oberseite eines gut konsolidiert Hybridkonstrukt zu demonstrieren. Das Konstrukt war leicht zu handhaben und kann an Ort und Stelle für Blasenaugmentation Zwecke oder Abdeckung von Hautdefekten genäht werden. Alle Teile der Gewebegerüst sind FDA genehmigt und die Technikkönnte für einstufige Verfahren von Gewebe Ernte, Zerkleinern, Kunststoff-Komprimierung und Transplantation zurück in den Patienten als eine einstufige Eingriff eingesetzt. Das Verfahren könnte für Gewebeexpansion und des Wiederaufbaus unter sterilen Bedingungen in jeder der allgemeinen Chirurgie Einheit durchgeführt werden.

Protocol

Alle Tierprotokolle wurden von der Stockholm Ausschusses für Tiere im Voraus genehmigt und alle Verfahren entsprach den Vorschriften für Tiernutzung, sowie die einschlägigen Bundesgesetzen. 1. Tierversuchen Vorbereitung der Tiere für Chirurgie Bereiten Sie den OP-Tisch mit allen Materialien und Instrumente für den Betrieb erforderlich unter sterilen Bedingungen. Führen Sie die Operation ausschließlich unter sterilen Bedingungen das Risiko einer Infektion zu reduzie…

Representative Results

Diese Studie stellt eine Methode, die zeigt, wie ein Biomaterial für die Transplantation mit Kunststoff-Kompression von Kollagen und zerkleinerte Gewebe zu erzeugen. Blasenschleimhaut und die Haut und dann mechanisch zerhackt in kleine Partikel (Abbildung 3) geerntet werden. Durch plastische Kompression werden die gehackten Teilchen innerhalb des Verbundgerüst eines zentral angeordneten biologisch abbaubare Polymer eingearbeitet, die innerhalb der äußeren Schichten aus e…

Discussion

Diese Studie stellt eine einfach zu bedienende Ansatz zur Blasenwand Patches mit Eigengewebe für die Transplantation am OP-Tisch erzeugen. Die Flecken werden durch die Kombination eines biologisch abbaubaren Polymers Stricken in der Mitte und Kollagen mit und ohne zerkleinerte Gewebe in den Außenflächen in Kombination mit Kunststoff Kompression gebildet. Kunststoff-Komprimierung ist ein Verfahren bereits von anderen Autoren beschrieben und kann als eine schnelle Rückführung von Flüssigkeit aus Kollagengelen ^1…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3