압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

Summary

조직 공학은 종종 조직 재생을위한자가 이식을 만들기 위해 체외 확장에 포함되어 있습니다. 본 연구에서는 조직 확장 재생 및 생체 내에서 재구성하기위한 방법이 체외 세포 및 생체 물질의 처리를 최소화하기 위해 개발되었다.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

피부와 비뇨 기관에 이식에 대부분의 조직 공학 연구는 특별히 장착 된 세포 배양 시설 ^{1, 2의} 건강한 조직과 세포의 확장에서자가 세포 수확을 포함한다.

환자 이식술을 수신 할 준비가되었을 때 셀 전개 후, 세포는 일반적으로 나중에 사용하기 위해 저장된다. 질소 냉동고 -150 ° C 이하의 낮은 온도에서의 장기간 저장을 허용한다. 동결 프로세스는 신중하고 세포 손실하지 않도록 제어되어야한다. 세포 사멸의 한 위험 세포막의 파괴로 이어질 수 해동 과정 중 세포 내 물이 결정화된다. 동결 세포는 일반적으로 세포를 소 태아 혈청 및 디메틸 술폭 시드의 고 농도를 사용하여 천천히 제어 냉각 (-11 ° C 당 분)에 의해 수행된다. 해동 후, 세포를 동결 배지를 제거하고 세포 배양 용 플라스틱 또는 배양에 의해 다시 처리 될 필요다시 환자에게 이식하기 전에 생체 재료.

모든 상기 언급 된 단계는 시간 소모, 번잡하고 고비용 ^3. 또한, 환자의 이식을위한 세포의 모든 체외 처리는 매우 규제하고 잘 훈련 된 공인 인력과 실험실 ^{4 필요합니다.} 전부, 기술은 기술적으로 진보 센터 극소수에 설립 될 수 있고, 일반적인 수술 질환을 넓게 사용하기 어렵다, 안전하고 신뢰할 수있는 제조 공정을 조달.

실험실 환경에서 세포 배양의 한계를 극복하기 위해, 생체 내에서 세포 확장 다진 조직 이식의 개념은 바이오 리액터로서 본체 자체를 사용하여 도입된다. 이러한 목적을 위해,자가 이식 우선적 I의 장기의 최종 재구성에 필요한 형상에 따라 3D 금형에 이식 될^5-7 nterest.

원래, 다진 상피 세포를 이식의 아이디어는 그가 상피 세포가 상처의 가장자리에서 성장하는 방법을 설명 할 때 1958 년 온순한 제시했다. 그 피부의 작은 조각 (도 1) ^(8)를 수직 방향으로 두 조각을 절단하여 100 %로함으로써, 셀 확장 가능성을 마진을 증가한다고 입증 하였다. 이론은 피부 이식 ⁹ 맞물린 부분 층 피부 이식의 사용에 의해 지원 피부 모델 ¹⁰ 상처 ^{치유되었다.}

그림 1 :. 온순한 이론은 미크의 이론에 따르면, 상피 세포는 상처의 가장자리에서 성장. 닦지 기술에 의해 노출되는 면적을 증가시킴으로써, 다진 조직은 많은 점에서 상처를 epithelializes.

본 연구는 저자에 기초동일한 원리가 주형 주위 다진 상피 배치하여 피하 조직에 적용될 수 논문. (상기 내부 몸체로부터 이물 (금형) 상처 면적 분리 연속 neoepithelium을 형성하기 위해 상피 세포는 상처 영역 (마이그레이션) 커버 다진 이식 (재구성)로부터 동원 것이고 분할기 (확장) 그림 2).

그림 2. 선량의 이론에 따른 생체 intracorporal 조직 확장 다진 상피 3D 금형 만화 피하 조직에 금형에 배치 한 후 이식 다진 조직을 이용하여 상기 가설은 상피 세포에서 마이그레이션 있다는 다진 조직의 가장자리는 재구성 및 상처 면적 본체 내부에서 이물질 (몰드)을 분리하는 연속 neoepithelium을 형성하도록 확장.

이전의 생체 내 연구는 유망한 결과를 보여하지만 재생 된 상피 더 나은 ⁷ 기계적 충격에 견딜 수 있도록, 더 개선은자가 이식을 강화함으로써 달성 될 수있다. 쉬운 영양소와 폐기물의 확산 가능성 금형 3D 방식 외과 취급 용이성 이러한 목적을 위해 성공적인 생체 중요한 전제 같은 확인되었다. 결론이 요구 다진 티슈 복합 생체 재료를 첨가함으로써 충족 될 수 있다고 하였다.

에 다진 조직으로 구성된 인공 지지체의 개발을 목표로 현재 연구 생분해 성 섬유의 보강 코어를 포함하는 콜라겐을 플라스틱 압축. 이러한 방법으로, 실행 가능한 세포는 다진 조직의 입자에서 마이그레이션 수 있고 원래의 상피 (피부 또는 요로 상피)의 형태 학적 기능 특성으로 확산. 플라스틱 압축을 사용하여 비계 감소했다약 420 μm의 다진 입자로에 1cm의 크기 d는 상위 계층 콜라겐에 싸여 있었다. 코어 섬유는 중합체 일 수 있지만, 피복 콜라겐 층 ¹¹ 인터링크하기 위해 친수성 표면으로 변형 될 필요가 있었다.

이 방법은 다진 방광 점막 또는 돼지에서 다진 피부를 배양하기위한 발판으로 사용하여 두 개의 플라스틱 압축 된 콜라겐 젤 내에서 폴리 (ε 카프로 락톤을)로 구성된 니트 메쉬 (PCL)를 통합하여 향상된 발판 무결성을 제공했다. 구조는 잘 통합 하이브리드 구조물의 위에 층화 다층 요로 상피 또는 피부 편평 상피의 성공적인 형성을 입증하는 시험 관내에서 6 주 동안 세포 배양 조건에서 유지되었다. 구조는 취급이 용이이었고, 방광 확대 술의 목적이나 피부 결점 커버 장소에 봉합 될 수있다. 조직 골격의 모든 부분은 FDA 승인 및 기술되어있다티슈 닦지 수확 플라스틱 압축 및 단일 스테이지 개입 같은 환자에게 다시 이식하여 단일 단계 과정에 이용 될 수있다. 절차는 임의의 외과 부 멸균 조건 하에서 조직 팽창과 복원에 대해 수행 될 수있다.

Protocol

모든 동물 프로토콜은 동물의 스톡홀름 카운티위원회의 사전 승인을하고, 모든 절차는 동물의 사용뿐만 아니라 관련 연방법의 규정을 따른다. 1. 동물 절차 수술에 대한 동물 준비 무균 조건 하에서 작동에 필요한 모든 재료와 도구로 수술 테이블을 준비합니다. 감염의 위험을 감소시키고 생존 수술 조건을 최적화하기 위해 멸균 조건하에 단독으로 수술을 수?…

Representative Results

이 연구는 콜라겐과 다진 조직의 플라스틱 압축을 사용하여 이식 생체 재료를 생산하는 방법을 보여줍니다 방법을 제시한다. 방광 점막 및 피부는 수확 후 기계적으로 작은 입자 (그림 3)에 다진 할 수 있습니다. 플라스틱 압축하여 다진 입자 콜라겐 겔 (도 4)의 외층 내에 기계적으로 강한 중앙 배치 생분해 성 고분자로 이루어지는 복합체 지지체 내?…

Discussion

이 연구는 수술 테이블에 이식자가 조직과 방광 벽에 ​​패치를 생성하기 위해 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 패치와 플라스틱의 압축과 함께 외면 다진 조직없이 중간 및 콜라겐 분해성 중합체 편성의 조합에 의해 형성된다. 압축 성형 방법은, 이전에 다른 저자에 의해 기재된 콜라겐 겔 ^{(12, 13)에서} 유체의 급속 제적으로 정의 될 수있다. 방광 점막이나 피부 조직 다진이 지지체에 ?…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3