Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
De gist Saccharomyces cerevisiae biedt vele voordelen voor studies van moleculaire mechanismen van biologische processen, waaronder de studie van eiwitten die chromosoom functie regelen. Alhoewel er bekende voordelen van gist genetische, moleculaire en biochemische studies, is cytologisch onderzoek van de verdeling van eiwitten in de celkern gecompliceerd door zijn kleine omvang. De typische gist kern heeft een diameter van minder dan één micron, die slechts ongeveer 5 maal de resolutielimiet van zichtbaar licht. Aldus is de hoeveelheid informatie over de verdeling van nucleaire eiwitten die kunnen worden verkregen uit conventionele immunokleuring of door fluorescerend eiwit markeringen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP), beperkt. Een nuttige benadering voor het karakteriseren van de subnucleaire verdeling van eiwitten chromosoom oppervlak verspreidt. Deze benadering omvat het verwijderen van de celwand, verstoren cellen en nucleaire membranen, enllowing de oplosbare inhoud van de kern om zich te vestigen op het oppervlak van een microscoopglaasje. De onoplosbare componenten omvatten nucleaire matrix en chromosomen. Naast het feit dat verwijdering van oplosbare nucleaire inhoud, die de mogelijkheid om chromatine gebonden eiwitten te detecteren verbetert, het chromosoom verspreiden methode resulteert in aanzienlijke decompressie van chromosomen zodat verspreiding nuclei diameter van ongeveer 3-5 urn (bij diploïde meiotische kernen) en 2-3 urn voor diploïde mitotische kernen. Gedecomprimeerd maakt detectie van nucleaire substructuur die relatief moeilijk of onmogelijk te lossen in intacte kernen.
Een duidelijke tekortkoming op chromosoom verspreiding is de mogelijkheid dat de verspreiding procedure geheel of gedeeltelijk kan verstoren de structuur van belang. Van bijzonder belang is dat een bepaald chromosoom gebonden eiwit als gevolg van het verspreidorgaan procedure verloren gaan. Deze potentiële complicatie should in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van data. Een voorbeeld van een eiwit dat gevoelig is voor de verspreiding procedure beta-tubuline. Onder sommige omstandigheden, de spil, die hoofdzakelijk bestaat uit tubuline wordt behouden tijdens het verspreiden 3. Visualisatie van de spil vaak nuttig om kernen plaats podium. Echter, visualiseren tubuline vereist behandeling met een hoge concentratie fixeermiddel; spillen verloren onder de hieronder beschreven standaardomstandigheden. Dit voorbeeld illustreert dat, wanneer de analyse van de verdeling van een eerder gekarakteriseerde proteïne, is het belangrijk om de concentratie fixeermiddel te bepalen hoe gevoelig het eiwit met deze wijziging te variëren. Ondanks de bezorgdheid over de gevolgen van het verspreidorgaan voorwaarden chromosoomstructuur is het nut en de kracht van het verspreidorgaan werkwijze aangetoond in vele contexten en heeft brede toepasbaarheid bij karakterisering van mitotische en meiotische cellen bijzonder 4-7.
Two uitrijmethoden zijn uitgebreid gebruikt. De eerste van deze methoden ontwikkeld Dresser en Giroux 8, vermijdt het gebruik van detergens en kan verspreiden preparaten die lijken relatief goed geconserveerd chromosoom morfologie na kleuring voor DNA-specifieke kleurstof DAPI verkregen. Deze methode is relatief moeilijk te perfectioneren en de kwaliteit van het smeersel kernen varieert sterk, wanneer een gebied van een objectglaasje wordt in vergelijking met andere gebieden. Dit probleem kan kwantitatieve benaderingen die gepaard beeldvorming van veel niet-geselecteerde kernen van de ene dia naar data-acquisitie vertekening te voorkomen compliceren. De tweede chromosoom verspreiden methode, ontwikkeld door Loidl en Klein 1, gaat balanceren fixatie door paraformaldehyde, met lysis en chromatine decompressie gepromoot door een reinigingsmiddel. Wanneer goed uitgevoerd, deze methode geeft zeer reproduceerbare resultaten met minder regio tot regio verschillen ten opzichte van de Dresser en Giroux methode. Deze presentatie richt zich op een Modified van de methode van Klein Loidl en vanwege zijn betrouwbaarheid en eenvoud.
Chromosoom verspreiden is niet ingewikkeld of tijdrovend; tot 100 objectglaasjes kunnen worden voorbereid immunokleuring in één dag. Bovendien kan de verspreiding preparaten in de diepvries worden bewaard jaren voorafgaand aan immunokleuring en daarmee labs een repository van bevroren chromosoom spreads die kunnen worden gebruikt bij nieuwe biologische vragen rijzen of nieuwe kleurstoffen beschikbaar komen ontwikkelen.
De chromosoom dingswerkwijze wordt meestal gebruikt in combinatie met immunokleuring en groothoek fluorescentiemicroscopie, maar het is ook mogelijk om objectglaasjes voor superresolutie lichtmicroscopische werkwijzen zoals gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie bereiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
