Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

Summary

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Abstract

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein^1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

Introduction

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bietet viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der biologischen Prozesse, einschließlich der Untersuchung von Proteinen, die Chromosom-Funktion steuern. Zwar gibt es die bekannten Vorteile von Bäckerhefe für genetische, molekularen und biochemischen Studien wird zytologische Untersuchungen der Verteilung der Proteine ​​in den Zellkern durch seine geringe Größe kompliziert. Die typische Hefenukleus hat einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer, die nur etwa das 5fache der Auflösungsgrenze des sichtbaren Lichts ist. Somit wird die Menge von Informationen über die Verteilung von Kernproteinen, die von herkömmlichen Immunfärbung oder durch Verwendung von fluoreszierenden Protein-Tags, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP) erhalten werden können, ist begrenzt. Ein nützlicher Ansatz zur Charakterisierung der subnuclear Verteilung von Proteinen ist Chromosom Oberfläche ausbreitet. Dieser Ansatz beinhaltet die Entfernung der Zellwand, stören und Zellkernmembranen und einellowing Die unlöslichen Bestandteile des Kerns, um auf die Oberfläche eines Objektträgers zu regeln. Diese unlöslichen Bestandteile sind die Kernmatrix und die Chromosomen. Darüber hinaus ermöglicht die Entfernung der löslichen Kerninhalte, die die Fähigkeit zur Chromatin gebundene Proteine ​​erkennen erhöht, das Chromosom Spreizverfahren zu einer wesentlichen Dekompression von Chromosomen, so dass die Ausbreitung Kernen haben einen Durchmesser von etwa 3 bis 5 um (z diploiden meiotischen Kerne) und 2 bis 3 um für diploide mitotischen Kernen. Diese Dekompression ermöglicht den Nachweis von Kernstruktur, die relativ schwierig oder unmöglich, in intakten Zellkernen zu beheben ist.

Ein offensichtlicher Nachteil auf Chromosom Verbreitung ist die Möglichkeit, dass die Ausbreitung Verfahren kann teilweise oder vollständig die Struktur von Interesse stören. Von besonderem Interesse ist, dass einem bestimmten Chromosom gebundene Protein wurde, infolge des Streuverfahren verloren. Diese mögliche Komplikation should bei der Interpretation Daten gehalten werden. Ein Beispiel eines Proteins, das empfindlich auf den Spreizvorgang ist beta-Tubulin. Unter bestimmten Bedingungen kann sich die Spindel, die im Wesentlichen von Tubulin umfaßte, wird beim Aufspreizen ³ erhalten. Visualisierung der Spindel ist oft nützlich, um Kerne von Interesse Stufe. , Visualisierung Tubulin erfordert jedoch eine Behandlung mit einer hohen Konzentration Haarfestiger; Spindeln sind unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen verloren. Dieses Beispiel zeigt, dass bei der Analyse der Verteilung von einem zuvor nicht charakterisiertes Protein, ist es wichtig, die Konzentration an Fixiermittel, um zu bestimmen, wie empfindlich das Protein an eine solche Variation variieren. Trotz der Bedenken in Bezug auf die Auswirkungen der Verbreitung Bedingungen auf Chromosomenstruktur hat die Nützlichkeit und Leistung des Verteilungsmethode in vielen Zusammenhängen gezeigt und hat breite Anwendung in der mitotischen und Charakterisierung, insbesondere meiotischen Zellen ^4-7.

Two Verbreitung Methoden ausgiebig genutzt. Die erste dieser Methoden, die von Dresser and Giroux ⁸ entwickelt, vermeidet die Verwendung von Reinigungsmittel und Verbreitung Zubereitungen, die relativ gut erhaltene Chromosomen-Morphologie, wenn für die DNA-spezifische Farbstoff DAPI gefärbt zu haben scheinen zu ergeben. Allerdings ist dieses Verfahren relativ schwierig zu vervollkommnen und die Qualität der Ausbreitung Kerne variiert stark, wenn eine Region eines Schiebers zu anderen Regionen verglichen. Dieses Problem kann man quantitative Ansätze, die die Abbildung viele nicht ausgewählten Kerne von einer Folie zur Datenerfassung Verzerrungen zu vermeiden beinhalten erschweren. Die zweite Chromosomenverteilungsmethode, die von Loidl und Klein ¹ entwickelt, beinhaltet Ausgleichs Fixierung durch Paraformaldehyd, mit Lyse und Chromatin Dekompression durch eine Reinigungslösung gefördert. Wenn sie richtig durchgeführt wird, gibt diese Methode sehr reproduzierbare Ergebnisse mit weniger Region zu Region Variation im Vergleich zum Dresser and Giroux Verfahren. Diese Präsentation konzentriert sich auf eine Modified Version des Verfahrens von Loidl und Klein, wegen ihrer Zuverlässigkeit und Einfachheit.

Chromosom Verbreitung ist nicht kompliziert oder zeitraubende; bis zu 100 Objektträger für Immunfärbung an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus können die Ausbreitung Vorbereitungen in der Tiefkühltruhe für die Jahre vor Immunfärbung gespeichert werden und damit Labore können ein Repository von gefrorenem Chromosomen-Spreads, die verwendet werden können, wenn neue biologische Fragen stellen oder neue Nachweisreagenzien zur Verfügung zu entwickeln.

Das Chromosom verbreiten Verfahren wird am häufigsten in Kombination mit Immunfärbung und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, aber es ist auch möglich, Objektträger für die Super-Resolution-lichtmikroskopische Methoden wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie vorzubereiten.

Protocol

HINWEIS: Einige Schritte des Protokolls erfordern unter Arbeiten in einem sauberen Abzug. Außerdem erfordert das Verfahren eine Hefe Tetrade Präpariermikroskop mit einem 10X großen Arbeitsabstand Ziel ausgestattet Spheroplasting überwachen. Das Mikroskop sollte in der Haube vor der Zeit eingestellt werden. Entfernen Sie den Mikromanipulator Arm und Plattenhalter aus dem Anwendungsbereich und setzen diese Elemente in einem sicheren Ort weg vom Arbeitsbereich. 1. Herstellung von Sphäroplast…

Representative Results

Das Aussehen der Ausbreitung Kerne kritisch, hängt von der Balance zwischen Chromosom Fixierung und de-Verdichtung. Selbst wenn die Reagenzien korrekt ausgeglichen werden, kann die Variation in dem Grad der Chromosom de Verdichten in den verschiedenen Regionen der gleichen Folie und / oder zwischen verschiedenen Folien auftreten. Somit sollte die Qualität der Aufstriche in einer bestimmten Region eines Schiebers beurteilt werden, bevor Bilder interpretiert werden. Die Wirkungen der "?…

Discussion

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…

Materials

Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75×25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.