Поверхность Распространение и Иммуноокрашивание дрожжей хромосом
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
Многообещающий дрожжей Saccharomyces Cerevisiae предлагает множество преимуществ для изучения молекулярных механизмов биологических процессов, в том числе исследования белков, которые контролируют функцию хромосом. Хотя есть известные преимущества бутонизации дрожжей для генетических, молекулярных и биохимических исследований, цитологические исследования распределения белков в ядре клетки осложняется его небольшого размера. Типичный дрожжевой ядро имеет диаметр менее одного микрона, который находится всего приблизительно в 5 раз предел разрешения видимого света. Таким образом, объем информации о распределении ядерных белков, которые могут быть получены из обычных иммунным окрашиванием или с помощью флуоресцентного белка метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), ограничено. Полезный подход для характеристики субъядерного распределение белков поверхности хромосома распространения. Этот подход включает в себя удаление клеточной стенки, нарушая клетки и ядерные мембраны, аllowing нерастворимые содержимое ядра, чтобы оседают на поверхности предметного стекла микроскопа. Эти нерастворимые компоненты включают в себя ядерный матрикс и хромосомы. В дополнение к возможности удаления растворимых ядерных содержание, которое повышает способность обнаруживать хроматина связанных белков, хромосома распространения результатов метода в значительной декомпрессии хромосом, так что распространение ядра имеют диаметры около 3 до 5 мкм (для диплоидных ядер мейотических) и от 2 до 3 мкм для диплоидных ядер митотических. Это декомпрессии позволяет обнаруживать ядерной подструктуры, что относительно трудно или невозможно решить в интактных ядер.
Очевидным недостатком с хромосомой распространения вероятность того, что распространение процедура может частично или полностью нарушить структуру интерес. Особую озабоченность в том, что хромосома частности белком, могут быть потеряны в результате расширени процедуры. Этот потенциал осложнение ШоуLD иметь в виду, при интерпретации данных. Одним из примеров белка, который чувствителен к распространению процедуры бета-тубулина. При некоторых условиях, шпиндель, который состоит в основном из тубулина, сохраняется во время расширения 3. Визуализация шпинделя часто бывает полезно организовать ядра интерес. Тем не менее, визуализации тубулина требует лечения с высокой концентрацией фиксатором; шпиндели теряются в стандартных условиях, описанных ниже. Этот пример иллюстрирует, что при анализе распределения ранее неохарактеризованной белка, важно, чтобы изменять концентрацию фиксатора, чтобы определить, насколько чувствительный белок с таким изменением. Несмотря на озабоченность по поводу воздействия расширяющих условий на структуру хромосом, полезность и способность метода расширения была продемонстрирована во многих контекстах и имеет широкий полезность в характеристике митотической и, особенно мейоза клетки 4-7.
Общий весО способы расширения спектра широко используются. Первый из этих методов, разработанных Dresser и Жиру 8, позволяет избежать использования моющего средства и может дать расширенные препараты, которые появляются, чтобы иметь относительно хорошо сохранившийся морфологии хромосом при окрашивании DAPI для красителя ДНК конкретного. Тем не менее, этот метод является довольно трудно усовершенствовать и качество распространенных ядер значительно изменяется, когда одна область слайда по сравнению с другими регионами. Эта проблема может осложнить количественные подходы, которые включают визуализации много невыделенных ядра от одного слайда, чтобы избежать предвзятости данных приобретения. Второй способ распространения хромосом, разработанная Loidl и Клейна 1, включает в себя балансирование фиксацию параформальдегидом, с лизисом и хроматина декомпрессии продвигаемой растворе моющего средства. При правильном исполнении, этот метод дает очень воспроизводимые результаты с меньшим область-в-области изменения по сравнению с методом Dresser и Жиру. Эта презентация фокусируется на modified версия метода Loidl и Клейна, из-за его надежности и простоте.
Хромосома распространения не является сложным или времени; до 100 слайдов могут быть подготовлены для иммуноокрашивания в один день. Кроме того, распространение препараты могут быть сохранены в морозильнике в течение многих лет до иммунной, и, таким образом лаборатории могут разработать хранилище замороженных спредов хромосом, которые могут быть использованы, когда возникают новые биологические вопросы или новые окрашивания реагентов становятся доступными.
Способ распространения хромосом наиболее часто используется в комбинации с использованием иммунной и флуоресцентной микроскопии Widefield, но это также возможно, чтобы подготовить слайды для супер-разрешения световой микроскопии методами, такими как стимулируется обедненной выбросов (STED) микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
