Abstract
허혈성 뇌졸중은 혈관 구획에서 시작 뇌 상주 세포의 빠른 활성화를 포함하는 강력한 염증 반응을 시작합니다. 이 염증 반응의 핵심 메커니즘은 케모카인의 방출 증가 내피 세포 부착 분자의 발현에 의해 촉진 허혈성 뇌에 면역 세포를 순환의 이동이다. 뇌 - 침입 백혈구는 초기 단계의 보조 허혈 손상에 기여 잘 알려져 있지만, 염증과 이상 뇌 수리의 종료에 대한 자신의 중요성은 최근에 발견되었다.
여기서, 허혈성 뇌에서 마우스 면역 세포의 효과적인 분리를위한 간단한 프로토콜이 제공된다. transcardial 관류 후, 뇌 반구는 해부 및 기계적으로 분해된다. Liberase과 소화 효소는 미엘린 및 세포 파편을 제거 밀도 (예 퍼콜 등) 구배 원심 분리된다. 이 프로토콜 내가 하나의 큰 장점구배 시간 소모적 인 제조를 필요로하지 않으며, 확실하게 행할 수있다 단층 밀도 구배 방법이야. 접근법은 뇌 반구 당 재현성 세포 수를 산출 한 생물학적 복제 여러 유동 세포 계측법 패널 측정을 허용한다. 실험 뇌졸중 후 표현형 특성화 및 뇌 침입 백혈구의 정량은 허혈 손상 및 수리에서의 다각적 인 역할의 더 나은 이해에 기여할 수있다.
Introduction
뇌졸중은 빠르게 로컬 혈류 중단 이후에 시작하고 면역계의 거의 모든 부분을 포함 지속적인 염증 반응을 트리거한다. 이 염증 반응의 한 가지 중요한 특징은 뇌 내피 세포, 실질적 케모카인 분비의 활성화에 의해 구동 교감 유출 1-3 증가 뇌 면역 세포의 유입 시간 제한이다. 염증성 세포의 침윤이 이전에 허혈성 뇌졸중에 해로운 것으로 간주되었다, 그러나, 무차별 뇌에 백혈구 출구를 차단하기위한 여러 가지 치료 임상 시험은 측정 가능한 임상 적 혜택 4를 유도하는 데 실패했습니다. 최근에, 그것은 처음에 허혈성 손상 (5)의 진행에 관여하는 단핵구 유래 세포는 염증과 후속 조직 수리 (6)의 해결을 위해 중추적 인 역할을 할 수 있음을 분명하게되었다.
표현형과를 functi의 식별 덕분에단핵 세포와 대 식세포 사이도 그러 이질성은, 개발 및 염증의 해상도에서 단핵 식세포의 역할에 대한 지식이 크게 확장했다. 마우스에서, 순환하는 단핵 림프구 항원 6 착물 (LY-6C) (7)의 그 표면 발현에있어서, 적어도 두 개의 별개의 기능 집합으로 분류 될 수있다. LY-6C 높은 'inflammatory monocytes' 명확 세균 감염 (8)의 제어에 필수적인 것으로 나타 동안, 멸균 부상에서 그들의 역할은 논쟁이다. 허혈성 뇌졸중에서 CCR2 + LY-6C 높은 단핵 세포의 선택적 제거는 출혈성 경색 변환 6 결과. 그러나 동일한 실험 방법은 뇌내 출혈 (9) 후 급성 장애를 개선. 이와 유사하게, T 세포의 서브 세트는 다른 허혈성 뇌 손상에서 어느 열 해로운 또는 방호 조치 (11)을 발휘하는 것으로 생각된다, 그러나, 데이터이다 controversi등 12, 13 및 보증 추가 조사. 이 증가하는 복잡성을 감안할 때, 그것은 허혈 손상 및 수리에 다양한 면역 세포의 역할에 대한 깊은 지식이 게시물 스트로크 염증을 대상으로 치료에 실험 결과를 번역을위한 중요한 것을 분명해진다.
현재, 세포 면역 반응 분석을위한 가장 강력한 도구 다색 유동 세포 계측법이다. 그것은 편견에 필요한 생체 표지 또는 유전자 조작 (14)에 의해 시스템없이 염증의 사이트에 식별 및 다양한 면역 세포 하위 집합의 정량화 할 수 있습니다. 세포 내 사이토 카인 15 전사에 대한 항체와 세포 표면 마커의 동시 염색 (16)이 별도로 개인 식별 표현형 세포의 기능 상태에 관한 정보를 제공 인자. 하나의 큰 단점으로, 단일 세포 현탁액을 유세포 분석법 및 LOC 필요에 따라서 정보세포 침윤의 세계화가 손실됩니다. 조직학은 공간 정보를 얻기 위해 적합한 반면 그러나,이 특정 조직에서 면역 세포 아형의 특성을 한 번에 사용할 수있는 항체의 수에 의해 제한된다. 오늘날, 다양한 표면 마커의 유무의 조합이 명확 염증 17 중에 드문 면역 세포의 서브 세트, 특히 별개의 단핵구 - 유래 세포 집단을 식별하는 데 필요하다.
여기에서는 간단한 단층 밀도 구배를 사용하여 마우스의 뇌 허혈에서 높은 백혈구 수를 분리하기 위해 효율적인 프로토콜을 설명한다. 수득 된 세포 현탁액 중 세포 계측법 또는 상기 다차원 흐름에 의해 분석 될 수있는 매우 특이 하류 분석을 수행하는 유세포 분류 또는 면역 자기 선택에 의해 농축 될 수있다. 이 방법은 단일 세포 펜던트에 transcardial 관류, 뇌 반구의 제거, 뇌 조직의 분리 자세한 사항ensions, 유세포 분석 미엘린 제거 밀도 구배 원심 분리뿐만 아니라 항체 염색.
Protocol
모든 동물 실험은 (, 건강, NIH 공개 제 85-23의 미국 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 1996 개정 등.) 동물 케어 따라 표준을 준수하고 승인을 받아야하는 데 필요한 해당 국가 기관에 의해.
시약 1. 준비
- 소화 버퍼 (반구 당 1 ㎖) : 예를 들면 정제 소화 효소의 표준화 된 혼합물을 용해, Liberase 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 칼슘 2U / ㎖의 농도 (CA) 및 마그네슘을 둘러 써모 농도 (TL)와 마그네슘 (Mg)
- DNase의 세척 버퍼 : HBSS에서 666U / ㎖의 농도의 DNase I을 녹여 (칼슘 / 마그네슘 무료) 소 태아 혈청이 10 % 함유 (FCS)
- DNase의없이 버퍼를 세척 : HBSS (칼슘 / 마그네슘은 무료) FCS의 10 %를 포함
- 밀도 구배 매체 (반구 당 5 ㎖) : 재고 등장 밀도 기울기를 준비0, 매질 (SIP; 100 %) 한 부분 1.5 M 염화나트륨 밀도 구배 매체 아홉 부를 혼합하여. FCS의 3 %를 함유하는 HBSS 적절한 부피 (칼슘 / 마그네슘 무료)을 첨가하여 25 % 농도로 희석 SIP
- 계측법 (FC) 버퍼 유량 : 3 % FCS를 함유하는 (PBS)을 인산염 완충 식염수를 준비
2. 과도 중간 대뇌 동맥 폐색
참고 : 18 - 12 주 된 수컷 C57BL / 6 마우스에서 전술 한 바와 같이 관내 봉합 기술을 통해 일시적 중간대 뇌동맥 폐색 (MCAO)을 수행 하였다.
- 요약하면, 100 % 산소 2.0 %의 이소 플루 란 마취 마우스. 36.5 ° C에서 체온 유지는 피드백 제어, 가열 장치에 의해 0.5 ° C를 ±.
- 경동맥 외부 경동맥을 결찰 한 후, 중앙 (C)의 원점으로 경동맥을 사전에 규격화, 실리콘 고무 코팅 된 필라멘트를 소개erebral 동맥.
- 45 분 후 재관류를 허용하도록 필라멘트를 제거합니다. 모의 - 조작 동물 즉시 허혈을 피하기 위해 중대 뇌동맥을 폐색 후 필라멘트를 철회.
3. Transcardial 관류 및 뇌 해부
- (칼슘 / 마그네슘 무료) 얼음처럼 차가운 HBSS로 튜브의 한쪽 끝을 침지하여 연동 관류 펌프를 준비합니다. 관류 튜브의 타단에 무딘 23 G 바늘을 고정시키고 완전 HBSS (칼슘 / 마그네슘 무료)로 튜브를 채우기 위해 펌프 스위치.
- 깊이 4 % 이소 플루 란 마취 마우스 및 CO 2 흡입으로 안락사.
- 플라스틱 트레이에 포함 된 해부 보드에 마우스 등쪽를 놓습니다. 확산 앞과 넓은 가능한 20 G 바늘 해부 보드에 고정 뒷발.
- 직선 1 × 2 이빨 집게와 복부 피부를 잡고 외피와 복부 벽을 통해 횡 절개를 만들기 위해 날카로운 홍채 가위를 사용하여 노출간.
- 흉골을 들어 올려 날카로운 / 무딘 홍채 가위의 무딘 칼날 다이어프램을 절개. caudocranial 방향으로 양측의 측면 갈비뼈를 잘라 계속합니다. 폐, 심장 및 흉부 동맥을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 무딘 집게로 피부 플랩을 들어 올리고 해부 보드에 핀. 조심스럽게 결합 조직에서 마음을 분리하는 무딘 엔드 집게와 가위를 사용합니다.
- 무딘 엔드 집게로 마음을 잡고 좌심실의 정점에 첨부 된 관류 튜브 무딘 23 G 바늘의 끝을 삽입합니다. 참고 : 심실 중격의 부상을 방지하기 위해 좌심실에 너무 멀리 바늘을 삽입하지 마십시오. 필요한 경우, 직선 날카로운 집게와 장소에 캐 뉼러를 해결.
- 선명한 홍채 가위로 우심방을 절개하고 즉시 펌프를 켭니다 (- 10 ml / 분 8 유량).
- 간 가벼운 커피 색상 (~ HBSS 30 ml)에 표시 될 때까지 관류를 계속합니다. 전역관류는 조심스럽게 튜브에 공기 거품 형성을 피할 수 있습니다.
- 단지 두개골 뒤에 바로 수술 가위로 마우스를 목을 벨. 두개골을 노출 두피의 중간 선 절개를 만들기 위해 홍채 가위를 사용합니다.
- 난원 매그넘에 선명한 홍채 가위 중 하나 팁을 놓고 두개골에 옆으로 잘라. 다른면에 대해 반복합니다.
- 선명한 홍채 가위를 사용하여 조심스럽게 코를 향해 중간 선까지 같은 공동에서 잘라. 뇌의 손상을 방지하기 위해 가능한 한 표면 가위의 끝을 유지하십시오.
- 부드럽게 각각의 뇌 반구에서 두개골 뼈를 벗겨 미세 집게를 사용합니다. 주 : 경색 조직 수막 또는 두개골에 부착 할 수있다 때문에 부주의 해부에 뇌 조직을 잃어 버리지 확인
- 주걱으로 머리를 들어 올려 조심스럽게 두개골에 고정 뇌 신경 섬유를 해부하는 날카로운 홍채 가위를 사용합니다. HBSS (+ 칼슘 / 마그네슘)의 10 ㎖로 가득 15 ML 튜브로 뇌를 놓고 그것이야 유지hortly 얼음.
단일 세포 현탁액으로 뇌 조직 4. 해리
- 조심스럽게 깨끗한 면도날와 뇌간 및 소뇌를 제거합니다. 뇌를 hemisect과 거의 동일한 크기의 세 조각으로 관상면을 따라 각각의 반구를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다.
- 말하다은 5 ML의 주사기의 플런저 끝 부분을 사용하여 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 각 반구의 조직을 해부. 지속적으로 얼음처럼 차가운 HBSS (+ 칼슘 / 마그네슘)와 셀 스트레이너를 씻어. 얼음에 균질 샘플을 저장합니다.
- 286 XG에 5 분간 4 ℃에서 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. 분해 완충액 1 ㎖에서 펠렛을 재현 탁하고, 2 ㎖의 튜브에 현탁 옮긴다. 1 시간 동안 37 ° C에서 느린 연속 회전에 따라 서스펜션을 품어.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 체 세포 현탁액 및 DNase의 무 세척 완충액 15 ml로 하였다 DNase를 함유 세척 완충액 3 mL로 충분히 씻어. 286 XG에 원심 분리기 5 분 동안 18 ° C 및 상층 액을 버린다. 참고 : 참고 : DNase의 사용은 세포 생존을 손상 세포 응집을 초래할 수있는 세포 용해에 의한 DNA의 점액을 제거합니다.
미엘린 및 세포 파편의 제거 5. 밀도 구배 원심 분리
- 5 25 % 밀도 구배 배지 mL 및 15 mL의 튜브 현탁액을 피펫에 재현 탁 된 세포 펠렛. 거품 형성을 방지 반복하고 부드러운 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다. 주 : 밀도 구배 매질은 세포 응집을 방지하기 위해 RT에서 사용되어야한다.
- 521 XG에 원심 분리기 20 분 동안 18 ° C. 회 전자의 가장 낮은 가속 프로파일을 사용하여 로터 브레이크없이 중지 할 수 있습니다. 부드럽게 흔들어없이 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 튜브의 하단에 세포 펠렛을 보존하면서 조심 미엘린 코팅 상청을 흡인. 주 : 남은이 impai 바와 같이 전체 수초 코트를 제거해야합니다R 유세포 분석.
- DNase의 자유 세척 완충액 10ml에 펠렛을 재현 탁하고 15 mL의 새 튜브에 현탁 피펫. 주 : 밀도 구배 매체의 충분한 제거가 현저 최종 세포 샘플의 양과 질에 기여 때문에 세정 공정이 중요하다.
- 다시 286 XG에 5 분 동안 10 ° C와 뜨는을 버리고 원심 분리기. 차가운 세척 버퍼 100 ㎕의 세포를 재현 탁하고 혈구에 트리 판 블루 배제하여 세포 수와 생존을 결정합니다. 저장 4 ° C에서 샘플을 신속하게 추가 과정을.
6. 항체 염색 유세포 분석
- 비특이적 결합을 방지하기 : 항체 라벨링 전에, 항 - 쥐 CD16 / CD32 FC 수용체 차단 시약을 10 분 (200 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도로 희석 인자 1) 4 ℃에서 세포 현탁액을 배양한다.
- 에서 형광 접합 된 일차 항체 추가세포 현탁액 (표 1에 나타낸 바와 같이)과 어둠을 20 분 동안 4 ℃에서 배양한다 ppropriate 농도. 참고 : 컨트롤 샘플은 일차 항체로 염색하지만, 그렇지 않으면 동일하게 취급되지 않습니다.
- 350 XG에서 FC 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖로 세포를 씻으 7 min.Carefully 10 ° C는 FC 버퍼 200 μL의 상층 액과에 resuspend 세포 펠렛을 대기음. 유세포 분석까지 어둠 속에서 일시적으로 4 ° C에서 보관 샘플.
계산 구슬에 의해 7. 절대 정량
- 반대로 FC 완충액 40 μL 형광 비드 알려진 번호를 포함 카운팅 튜브에 세포 현탁액 10 μL 피펫. 참고 : 피펫은 백혈구의 후속 계산이 볼륨을 참조로 샘플의 정확히 10 μl를 제공하기 위해 교정되었다는 것을주의하십시오.
- FITC 표지 CD45 항체 (최종 농도와 세포 현탁액을 품어100) 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 5 ㎍ / ml의 희석 요인 1.
- 반대로 어떤 세척 단계없이 FC 버퍼 200 μL와 계산 튜브를 작성하여 직접 흐름 cytometer에 CD45 + 세포를 기록합니다.
8. 유세포 취득
참고 : 제안 된 항체 패널을 분석하려면 해당 사이토는 FITC, PE,를 PerCP Cy5.5, PECy7에 대한 적색, 청색 (488 nm의), (635 ㎚)과 보라색 (405 ㎚) 레이저와 필터가 장착되어야한다, APC-Cy7 및 AmCyan.
- 허혈성 반구에서 흠없는 세포를 사용하여 앞으로 (FSC) 및 측방 (SSC) 분산 조정합니다. FSC의 면적과 높이를 나타내는 점 음모에 하나의 세포에서 이중선을 구별.
- 사용 된 각각의 형광 채널에 대한 단일 파라미터 히스토그램에있는 모든 단일 세포를 표시하고 광전자 증 배관 (PMT) 단일 세포까지 히스토그램의 왼쪽에 표시되도록 전압을 조정합니다.
- CD45-FITC 하나를 사용하여각 히스토그램 및 분산 플롯에서 CD45 높은 면역 세포를 백 게이트로 관심의 셀에 대한 분산 및 PMT 설정을 확인하는 스테인드 샘플. 주 : CD45 음성의 중간체 (INT) 및 고 발현 세포가 서로 구별 될 수 있도록 FITC의 PMT 전압을 적응.
- 멀티 - 색 보정을 수행하는 항체 캡쳐 보상 비드를 사용한다. 그림 1에 표시된 게이팅 전략에 따라 백혈구 소집단을 정의 이후 미세 아교 세포 (CD45의 INT) 및 백혈구 (CD45 높은)에 대한 게이트를 설정합니다.
Representative Results
대뇌 허혈은 왼쪽 중간 대뇌 동맥 (MCAO)의 과도 필라멘트 폐쇄를 통해 12 주 된 수컷 C57BL / 6 마우스에서 시작되었다. 가짜 작동을 위해 필라멘트는 왼쪽 중간 대뇌 동맥 폐색 삽입 및 인스턴트 재관류 할 수 있도록 즉시 철회되었다. 중요한 것은, 세포의 신경 염증은 일반적으로 적용되는 행정 모델 (19) 사이에 실질적으로 다르다. 이것은 인간의 뇌졸중의 이종 병태 생리에 동물 연구에서 연구 결과를 외삽 특히 염두에 두어야한다.
마우스는 허혈성 뇌에 초기 면역 세포 침공을 분석 MCAO 후 24 시간을 희생했다. 허혈성 반구에서 얻은 세포 수 (MCAO IPSI; ± 0.25 X 10E6 0.95) 밀도 구배 원심 분리는 반대측 반구에서 사람들에게 비교했다 후 (MCAO 콘트라, 1.09 ± 0.30 X 10E6) 및 동측가짜로 작동하는 마우스의 반구 (가짜 IPSI, 1.12 ± 0.18 X 10E6, 편도 ANOVA, p = 0.524). 트리 판 블루 배제에 의해 측정 된 분리 된 세포의 생존 능력은 높고 크게 96.85 ± 0.60 %, MCAO 콘트라은 97.12 ± 1.18 %, MCAO이 IPSI 95.68 ± 2.04 %, 편도-ANOVA, p = 0.253 가짜 그룹 (사이에 차이가 없었다 ).
MCAO은 유세포 분석에 의해 측정 한 후, 뇌의 조성물은 24 시간에 침투. 1 게이팅 전략 개략적으로 (A) 및 대표 뇌졸중 동물 (B)를 도시한다. 뇌 - 침투 백혈구는 CD45의 INT의 미세 아교 세포에서 분화 할 수 CD45 높은 세포로 정의 하였다. T 림프구는 CD45 높은 CD3 + 세포로 묘사 동안 CD45 높은 인구 내에서 다형 핵 호중구 (PMN)는, LY-6G 발현에 의해 확인되었다. 잔류 CD45 높은 세포를 구별 하였다CD19 (B 림프구)와 CD11b를 발현에 의해 에드. CD11b를 + 분율은 더 LY-6C 높은`염증 monocytes`와 단핵 세포, 수지상 세포 (DC)와 대 식세포를 포함 LY-6C 낮은 인구에 subcategorized했다.
뇌졸중 급성기, 골수 세포는 면역 뇌 3,20 침투 지배. 호중구가 혈관 폐색 후 빠르게 두뇌를 입력하고 염증성 단핵구 (21)의 혈관 외 유출을 촉진한다. 그림 2a는 반대쪽 반구와 가짜 수술에 비해 MCAO 후 허혈성 반구 24 시간에서 Ly6-G는 + 호중구의 비율 증가를 표시합니다. 대조적으로, 허혈성 반구 CD3 + T 세포의 비율은 건강한 뇌에서보다 (상대적으로) 더 낮다. CD11b를 + 인구 내에서 뇌 허혈은 LY-6C 높은 염증성 단핵구의 강한 우세 (그림으로 균형을 이동2B).
상대적인 분포에 더하여, 계산 튜브 CD45 양성 이벤트에 기초하여 샘플 (도 3)으로 면역 세포 서브 세트의 절대 수치를 결정하는 데 사용 하였다. 계산 튜브 형광 구슬의 알려진 수를 방출하는 동결 건조 된 펠릿을 포함합니다. 시료 양성 세포의 절대 수는 이벤트 비드 셀룰러 이벤트 관련하여 결정될 수있다. 하기 식을 사용 하였다 반구 당 CD45 높은 백혈구 수를 계산 : 반구 당 CD45 높은 세포 = (CD45 높은 이벤트 X의 총 카운트 비드 / 샘플 비드 건) × (총 현탁 부피 (100 μL) / 샘플 볼륨 (10 μl를 )). 24 시간 MCAO 이후 경색 반구 총 백혈구 크게 반대쪽 반구와 가짜 수술에 비해 증가 하였다 (도 3d, 일방향 ANOVA, p = 0.0004). 디의 카운트 stinct 면역 세포 서브 세트 (PMN은 T 세포는 B 세포가 LY-6C 높고 LY-6C 낮은 단핵구)를 용이하게 각 샘플의 총 CD45 높은 백혈구 수와 상대 빈도를 곱함으로써 계산 될 수있다.
유동 세포 계측법 그림 1. 게이팅 전략. (A) 게이팅 전략의 도식입니다. (B)는 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 대표 마우스 뇌 24 시간에서 분리 된 백혈구의 유세포 분석을 보여줍니다. FSC 앞으로 분산, PMN의 다형 핵 호중구, CDC 고전 수지상 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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면역 세포 하위 집합의 그림 2. 차별화. LY-6G + -neutrophils (A)의 상대 분포, 차동 동측 (IPSI)에 LY-6C (B)의 발현과 반대측 (식별 CD3 + T 세포 (A)와 단핵구의 부분 집합 콘트라) 반구 중대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 또는 각각의 모의 수술 후 24 시간. 각 인구의 비율이 게이트에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
구슬을 계산하여 뇌 백혈구의 그림 3. 정량. (A)는 높은 더블 긍정적 인 비드 게이트를 보여줍니다. 단일 세포 집단 내 (B) CD45의 INT의 미세 아교 세포는 CD45 높은 백혈구 (C) 구별 할 수 있습니다. 정량, 게이트 CD45 높은 이벤트의 수는 카운트 비드 이벤트로 정규화 하였다. 그 총 백혈구 주 (CD45 높은) 수는 상당히 중대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 후 반대측 (콘트라) 반구와 가짜 수술에 비해 24 시간 동측 (IPSI) 반구 증가된다. ** p <0.01, *** p <편도 ANOVA 및 Tukey`s 사후 다중 비교 시험 0.001. N = 4 - 그룹 당 6. FSC 앞으로 분산 형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 형광 색소 | FITC | PE | 를 PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| 항원 | CD45.2 | CD3 | LY-6G | CD19 | LY-6C | CD11b를 |
| 최종 농도 [μg의 / ㎖] | (5) | 1 | 0.2 | 0.2 | 1 | 1 |
| 희석 배수 | 1/100 | 1/200 | 1 / 1,000 | 1 / 1,000 | 1/200 | 1/200 |
| 복제 | (104) | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
허혈성 뇌의 면역 세포 식별 표 1. 기본 항체 칵테일.
Discussion
여기서는 실험 뇌졸중 후 쥐 뇌에서 백혈구의 분리를위한 간단하고 효과적인 방법을 설명한다. 접근 한 생물학적 확실 복제 상이한 흐름 패널을 측정 할 수 있도록 뇌 반구 당 재현성 세포 수를 산출한다.
명백하게, 혈액을 포함한 면역 세포의 불완전한 제거는 허혈성 뇌 입력 염증 세포의 실제 양에 대한 왜곡도 발생한다. 이 프로토콜을 사용하는 경우 즉, 비염증성 순환 백혈구 침투 면역 세포의 오염을 방지하기 위해 철저한 transcardial 관류에 특히주의. 경험에서, 좌심실 펑크에 대한 무딘 바늘의 사용은 전신 순환의 관류를 우회 할 심실 중격의 부상에 대한 위험을 줄일 수 있습니다. 콧 구멍에서 관류 액의 출현 관류 따라서, 너무 높은 pressureis 기호이며,보이드 유량> 10 ㎖ / 분. 분홍빛이 도는 색상이 좋지 관류의 표시 상태에서 뇌 조직의 화이트 색상에 창백한 좋은 관류를 나타냅니다.
이 프로토콜의 다른 중요한 단계는 기계적 분열뿐 아니라 소화 효소를 포함하는 뇌 조직을 효율적으로 분리된다. 셀 스트레이너를 통해 조직을 닦지하는 프로테아제의 개선 된 효능을 제공하기 위해 중요하다. 조직을 균질화 할 때 단핵 식세포가자가 분해 (22)에 매우 민감하지만, 과도한 압력을 피하십시오. 효소 소화 Liberase TL의 경우 중립 프로테아제 써모의 낮은 농도를 포함 고순도 콜라겐 I 및 II의 혼합물 인 것이 좋습니다. Liberase TL 처리 (KM 게시되지 않은 데이터)에 의해 실행 가능한 세포의 상당히 높은 복구를 밝혀 앞서 설명한 분리 프로토콜 14,22,23와 직접 비교. 콜라게나 제에 비해 자주 사용되는뇌에서 면역 세포의 분리를위한 d를, Liberase TL은 독소의 무시할 수준이 포함되어 있습니다. 독소의 높은 수준의 면역 세포 (24)의 작동 상태를 변경하고 심각한 세포 배양을 방해 할 수 있으므로 셀 (25)의 하류 성과 분석을 위해 정렬되는 경우에 특히 중요하다. 전통적인 콜라게나 제의 또 다른 단점 결과의 재현성을 위태롭게하고 각 로트 (26)의 작업 농도의 결정을 필요로하는 효소 활성에 중요한 로트의 차이입니다.
성인 뇌에서 밀도 구배 원심 분리에 의해 제거 미엘린은 유전자 또는 단백질 발현에 유동 세포 계측법 또는 추가 연구 다운 스트림 애플리케이션에 필수적인 단계이다. 프로토콜의 한 가지 중요한 장점은 구배 시간 소모적 인 제조를 필요로하지 않고 단일 층 밀도 절차이다. 또한, 분리 프로토콜은 신뢰할 수있는 결과를 생성오히려 경험 실험자에 의해 수행되는 경우에도에요. 이 사이에 인터페이스를 방해하지 않고 하나의 피펫하기 어려운 그 다른 가까운 밀도 층 그라디언트없는 것입니다.
표면 마커 CD45의 발현에 기초하여, 프로토콜은 허혈성 뇌 세포 세 가지 주요 카테고리를 산출한다. 세포의 대부분은 신경 세포, 별아교 세포, 뇌실막 및 내피 세포로 구성된 CD45 네가티브 인구에 속한다. 그들의 존재가 풍부한 주로 효율적 수초 나 이물질의 제거를 목표로 단층 밀도 구배에 기인한다. 또한, 주민 미세 아교 세포 (27)를 나타내는 CD45의 INT 인구는 주로 혈행 백혈구 침투가 포함 된 CD45 높은 인구 차별화 할 수 있습니다. 그러나, 활성화 된 미세 아교 세포는 혈액 태생 골수 세포의 표현형 및 기능을 채택 할 수 있음에 유의해야한다. 따라서, 만 적용 닳고 닳은28 parabiosis로 D 기술 등, 골수는 29 키메라 또는 운명 매핑 분석 (30)는 염증 동안 두 집단 사이에 명확한 구분을 할 수 있습니다.
유동 세포 계측법에서 데이터 분석은 종종 특정 세포 집단의 비율 분포로 제한된다. 비 경색 뇌 조직에 반구 경색 비교 때 허혈 손상에 의해 변경되는 전체 뇌 백혈구 수를 고려하지 않기 때문에,이 정보가 잘못 될 수있다. 면역 세포 하위 집합의 스트로크 상대 분포는 절대 세포 수에 의해 보완되어야한다 후에 따라서, 크기 및 염증성 침윤의 표현형에 대한 전체 그림을 그립니다. 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 마이크로 비드를 사용하는 경우, 정확한 샘플 부피 피펫은 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 절대적으로 필수적이다. 또한, 역 피펫 강하게 계산 튜브에 거품 형성을 방지하는 것이 좋습니다. 기포 발생마이크로 비드 예상 용적을 감소시키고, 따라서 샘플 절대 CD45 높은 백혈구의 과대 추정을 초래할 것이다.
요약하면,이 프로토콜은 뇌로부터 면역 세포를 분리하기 쉽고 신뢰성있는 방법을 제공한다. 또한 허혈성 뇌졸중에 염증성 반응의 복잡성을 해부 유용한 도구로서 작용할 수있다. 미래의 애플리케이션은 전파 및 허혈성 뇌 염증 해상도 단핵구 서브 세트의 시간에 따른 역할 조사를 포함한다. 마찬가지로, 뇌졸중 후 적응 면역 시스템의 역할을 제대로 이해된다. 장기 뇌졸중 후 회복과 새로운 치료 방법의 개발을위한 따라서 오픈 유망 도로에 미치는 영향을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다 현장에서 일부 특정 전사 인자 또는 사이토 카인의 발현에 의해 확인 된 T 세포 개체군의 세포 계측 분석 흐름.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 뛰어난 기술 지원 이사벨 슐츠 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
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