Introduction
Патогенные микроорганизмы могут образовывать биопленки в естественных условиях , приводящих к неострыми хронических инфекций 1. Биопленки-ассоциированной инфекции является серьезным фактором риска медицинских процедур, связанных с вживление инородных предметов (например, искусственные замены костей, грудные имплантаты) или установку трахеи трубок или мочевые катетеры 2. В этом контексте, антиинфекционной терапии почти всегда необходимо , так как биопленка на основе инфекции редко очищается самостоятельно, даже у иммунокомпетентных лиц. Золотистый стафилококк является одним из наиболее часто встречающихся патогенов , причастным биопленки осложнений , связанных , возникающих в процессе использования инвазивные медицинские устройства 3.
К сожалению, сама природа биопленок как защитный барьер делает их более устойчивыми к лечению , чем планктонных клеток 1,4, и оценка прогнозируемой клинической эффективности является важной частью как начальнаяразработки лекарственных средств, а также надзор за лекарственной устойчивостью. Существует все больше признание того, что лабораторные условия, ориентированные на планктонных культур, не может точно представлять реальную болезнь 5. Еще более усугубляет проблему, репликация биопленки фенотипов трудно, и существующие модели биопленки являются утомительным и страдают от высокой меж- и изменчивости внутри анализа 6. Таким образом, многие исследователи, по необходимости, по умолчанию планктонных клеток анализов лекарственной чувствительности, тем самым потенциально пренебрегая важный аспект бактериальной вирулентности и болезни.
Здесь мы опишем протокол для опробования бактерий, в частности S. стафилококк, в предварительно выращенных биопленок с использованием 96-луночного системы на основе биопленки 7,8. Хотя протокол для образования биопленки и вызов следует по существу рекомендации производителя, мы представляем альтернативную информацию богатой методологии для количественной оценки жизнеспособности biofILM после заражения. Вкратце, бактерии культивировали в колок пластине, где биопленки образуют на выступающими штифтами, прикрепленных к крышке пластины. После образования биопленки, колышки осторожно опускают в лунки свежей пластинки, заполненной PBS, чтобы удалить планктонные клетки. Колышек крышкой, с биопленок прикрепленными, переносится на новый вызов пластины, содержащей различные концентрации антибиотиков, которые будут проанализированы. После второй инкубации крышки снова удаляют, промывают, и переносили на пластину, содержащую восстановления резазурин краситель, где они подвергаются окончательному инкубацию. преобразование ресазурин могут быть записаны кинетически или взяты в качестве конечной точки чтения после определенного периода восстановления. Этот метод на основе красителя количественной оценки жизнеспособности биопленки значительно отличается от утомительных (образующих единиц колонии) КОЕ методологии рассчитывать на основе описанной в первоначальном протоколе 7. OD 600 измерения провокационной наркотиков пластины и резазурин кинетики превращения служат жизнеспособности чтениявыходы планктонных и биопленки клеток, соответственно, предлагая быстрый, надежный, богатый информацией и технически простой анализ для выживания биопленки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. биопленки Инициирование
- Выращивают культуру биопленки продуцирующего организма в питательной среде, богатой. Привить стафилококка штамм Ньюмена в 10 мл Мюллера-Хинтон среды из глицерина запасов. Выполнение всех работ , связанных с обращение с S. стафилококк в перчатках и в кабинете биологической безопасности.
- Инкубируют в течение 16 часов при 37 ° С на ротационном шейкере (100-200 оборотов в минуту).
- Определение OD 600 культуры , используя спектрофотометр и стандартную кювету (длина пути: 1 см).
- Рассчитать объем (V) культуры , необходимой для приготовления 20 мл инокулята с OD 600 (прививочный материал ) от 0,1 в chelexed Roswell Institute Memorial Park медиа (CRPMI) 9 с использованием формулы: [V = 20 мл * 0,1 / OD 600 (культура )]
Примечание: Ссылка 9 содержит подробные сведения о подготовке CRPMI.- Добавить расчетный объем культуры (сверху) в центрифужную пробирку и гранул клеток путем прядения в течение 1 мин при 10000 х г. Для Подготовительномповторно биопленки инокулята, аспирация истощенной средой роста и ресуспендируют осадок клеток в 20 мл CRPMI.
- Налейте прививочный материал в 25 мл резервуар.
- Осторожно снимите крышку из стерильной 96-луночного колышек пластины, потянув ее прямо вверх.
Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не загрязнить колышки свисающие с крышкой. Крышка может быть перевернут на чистую поверхность внутри шкафа биологической безопасности. - С помощью пипетки 200 мкл многоканальный, добавьте 125 мкл посевного материала в каждую лунку ряды А до G нижней пластины.
- Заполните 125 мкл стерильной среды CRPMI в каждую лунку ряда H в качестве контроля стерильности.
- Возьмите Peg-крышку и держать ее над пластиной дна с колышками лицевой стороной вниз. Тщательно выровняйте отдельные колышки с их соответствующие лунки. Избегайте физического контакта между пластиной и колышков. После того, как выровнен, опустите крышку вниз осторожно. Избегайте перекосов, как перенастройка выполняемые после колышками коснулись нижней плиты может CONTaminate управления стерильность в строке H.
- Закрыть крышку к пластине с парафиновой пленкой для предотвращения испарения и место в закрывающийся пластиковый пакет, уплотнение плотно. Держите объем воздуха в сумке как можно более низкой, чтобы свести к минимуму испарение.
- Выдержите без встряхивания при 37 ° С в течение 48 ч в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
Примечание: 48 ч роста было оптимальным для S. стафилококк, но будет меняться в зависимости от используемого организма.
Примечание: Хотя статическая Инкубационный является хорошей отправной точкой для оптимизации анализа, осторожно встряхивая при 150 оборотах в минуту на микропланшетов шейкере возможное изменение , которое может усилить образование биопленки некоторых S. стафилококка изолятов.
2. Подготовка биопленки Вызова плиты
- В день биопленка вызов принимают свежий 96-луночный планшет и добавляют 100 мкл CRPMI, сравняться с комнатной температуры, в каждую лунку рядов Б к H. Чтобы избежать противоречивые результаты, используют 96-луночный планшет, который может содержать 200 мклсредств массовой информации, когда колки находятся внутри, и особенности скважины с размерами, аналогичными инициирующего биопленки пластины.
- Развести до 4-х тестируемых соединений по отдельности в 1,0 мл CRPMI до 2x желаемой конечной концентрации, с целью учета для окончательного разведения в шаге 2.7.
Примечание: Хорошей отправной точкой в 8 раз выше подавляющей концентрации планктонных клеток. - Добавить 200 мкл соединения 1 в лунках А1 до А3, соединение 2 в колодцах А4 до А6, соединение 3 в колодцах А7-А9 и соединения 4 в скважинах A10 до A12.
- Серийно разбавить тестируемых соединений с помощью многоканальной пипетки и передачи 100 мкл из ряда А до ряда В и перемешать.
- Таким образом, по-прежнему передавать 100 мкл скважины к скважине. Смешайте после каждой передачи и остановки в строке F.
- После смешивания, высылать по 100 мкл из ряда F в контейнер для отходов. Не передавать любую жидкость в строки G и H.
- Добавьте 100 мкл CRPMI в каждую лунку планшета с помощью многоканальной пипетки длядовести объем до 200 мкл. На рисунке 1 окончательной компоновки пластины.
3. биопленки вызов
- Добавьте 200 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS) в свежую стерильную 96-луночного планшета, который показывает скважины с размерами, аналогичными инициирующего биопленки пластины.
- Удалите пластиковый пакет и парафиновую пленку из инкубированных инициации биопленки пластины.
- Поднимите крышку вертикально вверх. Избегайте контакта между колышками и пластиной дна, так как это может привести к повреждению биопленки. Держите нижнюю часть для последующего анализа OD 600 (см 3.8).
- Смывать планктонные клетки путем размещения Peg-крышку на пластину, содержащую PBS (со стадии 3.1). Погрузитесь колышки в течение 5 секунд, поднимите из PBS, и погрузите еще раз, соблюдая осторожность, чтобы не ударить колышки против сторон а.
- Поместите промытый Peg-крышку в вызов пластины. Избегать ненужного контакта между колышками и нижней пластиной, так как это приведет к повреждению биопленки приводит кпротиворечивые результаты.
- Уплотнение плита с парафиновой пленки и поместить в закрывающийся пластиковый пакет, как описано в шаге 1.10.
- Инкубируйте планшет без встряхивания в течение 24 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
- Возьмите нижнюю часть инициации биопленки пластины из 3.3. Ресуспендируют бактерии в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и измерить OD 600 с помощью подходящего микропланшет - ридером , чтобы подтвердить рост происходит во всех скважинах , кроме контроля стерильности в строке H.
Определение 4. биопленки
- С помощью планшет-ридер, оснащенный инкубационной камере и способный принимать кинетические Измерение флюоресценции для обнаружения ресазурина преобразования. Настройка кинетического измерения флуоресценции 24 ч, используя 530 нм возбуждение и на 590 нм излучение.
- Установите температуру в камере до 37 ° С и имеют пластины чтения каждые 20 мин. Установите планшет-ридера для измерения от нижней части пластины в соответствии с обу изготовителяции.
- Приготовьте промывочный пластины путем добавления 200 мкл PBS с помощью многоканальной пипетки в стерильную 96-луночного планшета.
- Подготовка биопленки среды восстановления путем добавления 400 мкл 0,8 мг / мл маточного раствора резазурин к 20 мл CRPMI среды до конечной концентрации 16 мкг / мл резазурин.
Примечание: ресазурин является известным раздражителем кожи. Используйте лабораторный халат, Очкидлязащитыотбрызг и перчатки при работе. CRPMI как восстановление биопленки сред используют потому, что он обеспечивает самый низкий фоновый сигнал, но он может быть заменен на Мюллера-Хинтона сред, если это необходимо. - Добавьте 150 мкл среды биопленки восстановления с помощью многоканальной пипетки в каждую лунку свежей 96-луночного планшета.
- Передача вызов пластины из инкубатора в шкаф биологической безопасности и осторожно снимите полиэтиленовый мешок и уплотнительную пленку.
- Удалите Peg-крышку с провокационной пластины и смыть планктонные клетки в PBS, как описано в разделе 3.4. Держите нижнюю часть пластины вызов для последующего OD 600 анализис (см 4.10).
- После промывки поместите Peg-крышку в нижней части пластины, содержащей среду восстановления биопленки.
- Оберните сторону плиты с парафиновой пленки, стараясь не мешать нижней части периметра скважин. Сразу же после того, как оберточная пластину, поместите его на планшет-ридере и начать кинетическую чтение в течение периода 24 ч, инициируя ранее сделал ресазурин кинетического протокола с шага 4.1.
- Для количественной оценки роста планктонных клеток , которые могут или не могут возникнуть во время вызова, читать OD 600 всей нижней задачей пластины с помощью микро - ридере. Следуйте инструкциям, приведенным в пункте 3.8.
Примечание: Тщательно ресуспендирования содержимое каждой лунки, как клетки, проливающие от биопленки, как правило, растут в сгустки на дне колодца. Любые пузырьки внутри скважины будет сильно мешать OD 600 показаний и его следует избегать или удалены до чтения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ ресазурин достаточно чувствителен, чтобы надежно обнаружить очень мало жизнеспособных клеток, способных к репликации в среде без наркотиков после того, как вызов. В этой методологии мы определяем минимальную биопленки искоренении концентрацию как самую низкую концентрацию, при которой никакое преобразование ресазурин не рассматривается в течение 24 часов. Анализ ресазурин зависит от окислительных молекул, обнаруженных в метаболически активных клеток, которые трансформируют цвет красителя от синего до розового цвета. преобразование красителем, таким образом, является показателем роста клеток, и может быть определена количественно с помощью флуоресцентного микро- планшет-ридера. В данной работе, neocuproine и Cu-neocuproine (neocuproine комплекс с медью) были испытаны на их активность в отношении биопленок связаны S. стафилококк применения макета , который основан на рисунке 1. Данные , полученные в ходе выполнения протокола являются считывание ОП 600 инициирующего биопленки пластины, которая служит в качестве контроля качества (данные не показаны), Показание OD 600 нижней пластины после того, как вызов был завершен (фиг.2А), и кинетический запись преобразования резазурин в его флуоресцентный метаболит ресоруфина от восстановления пластины (Фигура 2В). Кроме того, конечная точка образ провокационной пластины может быть использован для визуального осмотра преобразования резазурин (фиг.2С) , если да / нет оценки резазурин преобразования не является достаточным для целей эксперимента. В качестве альтернативы, если кинетические возможности записи недоступны или несколько планшеты работают параллельно, флуоресценция может быть определена через 24 часа с помощью одной конечной точки чтения. Как видно на фигуре 2А, О.Д. показания провокационной пластины показывают , что одни neocuproine не ингибирует рост планктонных клеток; Однако, Cu-neocuproine ингибирует рост в 1,3 мкМ, как и ожидалось 10. Аналогичная картина наблюдается с резазурин кинетики биопленки пластины, указываячто только Cu-neocuproine способна устранить метаболически активной биопленки-ассоциированных клеток (рис 2б).
В дополнение к обеспечению концентрации эрадикации биопленки, кинетический анализ дает информацию о состоянии метаболического биопленки, которое указывает количество жизнеспособных бактерий. При сравнении биопленок обрабатывались гентамицином при возрастающих концентрациях к необработанным контролем, отставание от резазурин преобразования можно увидеть (рисунок 3). 2,5 мкг / мл гентамицина, имеется задержка 13 ч до тех пор, пока не достигнет хорошо ту же конверсию резазурин в качестве необработанного контроля. Эта задержка, вероятно, происходит от сокращения числа жизнеспособных клеток, присутствующих в обрабатываемом биопленки по сравнению с необработанными.
Рисунок 1. Задача компоновки пластины. Examplе расположение вызов пластины размещения параллельное тестирование четырех соединений в трех экземплярах в шести различных концентрациях. Необработанные и стерильность управления также включены. Макетирование поддерживает удобную в пластине подготовки серийных разведений с использованием многоканальной пипеткой. Концентрации в мкМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Определение минимальной концентрации эрадикации биопленки. Neocuproine и Cu-neocuproine были протестированы на ликвидации биопленки потенциала. (A) OD 600 был взят из запроса пластины после удаления штифтовых крышки для количественного определения роста биопленки диссоциированных клеток. Преобразование (B) ресазурин контролировали кинетически в IndiviДвойные скважины в течение периода 24 ч. Индивидуальные minigraphs показывают флуоресценции (РФС) с течением времени (24 ч). Отсутствие резазурин конверсии указывает на отсутствие живых. преобразование ресазурин указывает на наличие жизнеспособных клеток, проливающих от биопленки и растущих в среде восстановления. (C) Если кинетическое считывание не возможно или не нужен, то просто да / нет ответа на присутствие жизнеспособных клеток можно определить визуально от преобразования цвета синего резазурин к его розовой, восстановленной формы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Кинетический анализ ресазурин показывает тормозящее действие на бактерии в биопленки. Соединения не могут полностью искоренить биопленки встроенные клетки, но все еще может уменьшитьИК жизнеспособность. Это можно видеть при сравнении задержки резазурин конверсии скважин, обработанных различными концентрациями гентамицина. Скважины, которые имеют задержку в резазурин преобразования указывают на уменьшенное число жизнеспособных клеток. Черный (только средства массовой информации), Orange (0 мкг / мл), зеленый (0,3 мкг / мл), Синий (0,6 мкг / мл), фиолетовый (2,5 мкг / мл) и Серый (5 мкг / мл). & Dgr ; t относится ко времени дифференциала экспоненциального преобразования между резазурин необработанных и обработанных гентамицин образцов на приближенное половину максимального значения флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали модифицированный анализ биопленки для определения активности тестируемых ингибиторов на S. стафилококк биопленки сосредоточив внимание на метаболического состояния биопленки ассоциированных клеток. В то время как рекомендации в основном имитировали производитель описанный биопленки инициации и процедуры вызов, использование резазурин краситель для выявления и количественной оценки биопленки ассоциированных клеток, которые выживают 24 ч ингибитора вызов значительно упрощает рекомендуемую процедуру восстановления клеток (через водяной бане озвучивания) и последующего перечисления жизнеспособных клеток через подсчета КОЕ. Эта процедура рекомендуется производителем включает в себя, по меньшей мере 5 дополнительных шагов манипуляции, каждый из них подвержен ошибкам, трудоемким и непрактичным для автоматизации. Преимущество упрощения считывающий процедуру анализа шпенька пластины увеличивает его привлекательность для операций с высокой пропускной способностью и приложений.
Хотя длительный протокол по числу шагов, этого procedurе довольно концептуально простой, с несколько важных шагов. Что самое важное, способность многократно расти биопленки того же качества, имеет важное значение для получения воспроизводимых результатов. Кроме того, необходимо проявлять осторожность, когда удаление или замена Peg-крышку. Контакт в любой точке с стены хорошо был бы нарушить биопленки, искажая результаты. Более того, адекватная промывка имеет решающее значение: неустранение планктонные клетки в любой точке удаляет любую возможность измерения биопленки-ассоциированных бактерий. С другой стороны, хотя, мойка не должна быть слишком строгими; дополнительные этапы стирки может начать удаление биопленки, производя противоречивые результаты.
Колышек пластина подход имеет множество применений, в зависимости от желаемого полученных данных. Анализ описан здесь как кинетическое измерение насыщенной информацией метаболического превращения резазурин в флуоресцентным красителем 11. Это преобразование связано с сдвигом цвета от синего до розового (фиг.2С), который, в дополнительк количественному флуоресценции чтения, позволяет легко первоначального качественного считывания просто наблюдая преобразование. После снятия крышки вешалке, это преобразование также может быть определена количественно путем считывания оптической плотности при 600 нм должен флуоресценция возможности не доступны. Хотя флуоресценции в конечном итоге на плато максимальной конверсии красителя в каждую лунку (с пострадавшими), начало превращения красителя может быть использован для оценки метаболически активного населения в живых по отношению к необработанным контролем (рисунок 3). В наших руках, мы обнаружили, что каждый из ~ 100 мин задержка начала конверсии резазурин соответствует примерно 10-кратное уменьшение количества метаболически активных клеток в исходной прививочный материал по отношению к необработанным контрольным образцом (как определено на планктонных культуре клеток серийно разбавляют с шагом в 10 раз с использованием восстановления биопленки среды (данные не показаны)).
Помимо кинетических считываниями, хотя, модифицированный колышек пластиныметод более поддаются высокой пропускной способности проектов на наркотики по сравнению с первоначальным протоколом. Измеряя ресазурина преобразование в качестве конечной точки , а не кинетический, пользователь может генерировать двоичный анализ проб для отслеживания простой активности соединений (то есть превращение краситель / нет преобразования), которая устраняет необходимость в течение 24 часов в флуоресцентном счетчике пластины , разрешая обычные инкубацию. Эта методика позволяет определить минимальную концентрацию биопленку искоренении без необходимости озвучивания и обшивкой. Кинетическая Читай также отслеживает метаболическое состояние биопленки в зависимости от условий обработки и концентрации ингибитора. Уменьшенное количество стадий манипулирования, увеличение воспроизводимости и количественный метод считывания (в отличие от обшивки в каждую лунку по отдельности 12) позволяет пользователям скрининга потенциально тысячи соединений в день в одном экране концентрации. На самом деле, пластины колышек стиле были ранее использованы в высокой пропускной дрUG экраны для биопленки диспергаторов, хотя ресазурин (как здесь используется) является гораздо более экономичным выбором , чем собственной люциферазы реагента , используемого 13.
В то время как общее улучшение по сравнению с существующим протоколом производителя, анализ признакам здесь имеет определенные ограничения, нужно иметь в виду. По своей сути, мы только измерения метаболизма способность биопленки-ассоциированных клеток. Этот тест не измеряет биопленки массы или иным образом ослабить архитектуру или целостность биопленки. Эти эффекты не обязательно будет обнаружен. Метаболически неактивны, но по- прежнему жизнеспособны, стойкая бактерия клеток, которые , как было показано существование в биопленок 14,15 также будут необнаруженными. Кроме того, соединения, которые индуцируют состояние покоя фактически не стерилизацией биопленки может ошибочно отображаться как количество ложных срабатываний, в зависимости от длины индуцированного состояния. Показатели Жизнеспособность в конечном счете, суррогаты для более железа одетых методов измерения, таких как проточной цитометрии или КОЕПеречисление, и конечный пользователь должен определить, какой метод подходит. Наконец, как преобразование ресазурин опирается на эндогенной НАДН, истощение внутриклеточных запасов может быть вредным для бактерий. В то время как мы не наблюдали пагубное воздействие против S. стафилококк, другие бактериальные виды могут реагировать по- разному. Пользователи должны эмпирически протестировать и проверить этот протокол для обеспечения надежности и воспроизводимости учетом различных организмов и лабораторных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K.
