등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

Summary

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Abstract

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Introduction

성체 줄기 세포 (SCS는) 죽어가는 세포를 대체하여 조직의 항상성 유지 부상에 손상된 조직을 복구에 필수적이다. 이 희주는 지속적인 자기 갱신을 받아야하고 다양한 세포 계통 ^1-3로 분화 할 수있는 능력으로 정의된다. 그 보급 용 성인으로 SC에 좌우되는 최고의 조사 시스템은, 조혈 시스템, 소장 및 피부 ^{1,2,4을 포함한다.}

배아 발생 동안, 피부 표피 세포의 단일 층으로 시작한다. 중간 엽 세포가 피부를 채우고 기초 콜라겐 진피 ^(5)을 형성 할 때 모낭 (HF)의 형태 형성이 시작됩니다. 아래쪽 ^{6 성장하기} 시작 머리 placodes을 형성 후에 모유두 (DP)를 구성하는 표피층 바로 아래 조직 및 상피 세포를 자극하는 중간 엽 세포를 전문. 높은 HF의 하부에 위치한 기질 세포를 증식,내층 모발 (HS) 및 주변 내측 근초 (IRS) ^2,3-을 형성하는 동심의 실린더로 분화되기 시작하면서,이 중간 엽 세포 봉투와 모구를 형성한다.

interfollicular 표피 (IFE), 피지선 (SG)와 HF : 출생 후의 생활에서 피부 표피는 세 구획으로 구성되어 있습니다. 항상성의 일정한 상태에있는 IFE SG와 대조적으로, HF 연속 성장주기 (성장기) 파괴 (퇴행기)과 나머지 (텔로 겐) ^-4,7-를 거쳐 동적 미니 기관이다. 모낭 줄기 세포 (HFSCs)이 연료이 영구 사이클은 팽창 ^4로 알려진 HF 내 전문 틈새에 있습니다. 민주당에서 활성화 신호를 상기 HFSCs은 팽창을 종료 성장기 다음 중 증식을 시작하고 아래로하여 외부 루트 시스로 알려진 세포의 긴 선형 흔적을 만들어 내려 (ORS) ^8-10. 매트릭스 셀, 즉HF를 빠르게 순환베이스에서 DP를 둘러싸고 따라서 HS 및 IRS ⁽¹⁰⁾ (도 1)를 생성하는 단말 분화를 겪고 상향 이동한다. 성장기의 기간은 모발의 길이를 결정하고, 행렬 셀 ^(6)의 증식 및 분화 능력에 의존한다. HF가 퇴행기 들어가면 전구 중단의 전송 증폭 매트릭스 세포 증식 아폽토시스를 겪게하고이 HF ^8,11의 비 사이클의 부분에 도달 할 때까지 위쪽으로 DP 당기는 동안 완전히 퇴행한다. 이 후퇴하는 동안 HF는 퇴행기의 특징 상피 가닥으로 알려진 임시 구조를 형성하고, 많은 사멸 세포를 포함한다. 마우스에서, 퇴행기 3-4 일 간 지속 높은 제 헤어 사이클에서 동기화된다. HF는 휴지기에 도달하면 모든 HFSCs이 정지된다. HF 사이클의 구별 단계는 m에 의해 마우스의 피부의 색의 변화에​​ 의해 특징 지어진다elanin 생산. 퇴행기 동안 어두운 회색으로 성장기 동안 검은 색의 피부 변화는 휴지기 ^6,7,12,13 동안 핑크합니다.

그림 1 : 헤어 난포주기. HF는 영구 상부의 구성과 빠른 성장 (성장기), 파괴 (퇴행기) 및 상대 정지 단계 또는 휴식 (휴지기)의 연속 사이클을 겪는다 낮은 지속적으로 리모델링, 자전거 부분은.되어 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

HF를 유지 희주는 처음에 그냥 SG ⁽¹⁴⁾ 아래 HF의 영구 지역에 거주 느린 자전거 레이블 유지 셀 (LRC)의 인구를 밝혀 삼중 티미 딘와 체이스 실험을 이용하여 확인 하였다. HFSC의 발전특성은 HF 틈새 ^{(15)로부터} 특정 희주를 식별하고 분리하는 데 사용할 수있는 마커의 작은 숫자를 한 것으로 밝혀졌습니다. 아마도 HFSCs의 농축을위한 최선의 마커 CD34, 또한 인체 ^(16)의 조혈 SC 마커로 확인 된 세포 표면 마커이다. 이 CD34 ⁺ 집단 내에서 두 가지 인구는 고립 α6의 인테그린 식 ^{2를 기반으로하고있다.} 또 다른 마커 CD34의 발현과 공동-지역화 및 K15 프로모터 타겟팅 및 형질 전환 동물 ^15,17-19에 HFSCs 분리에 사용되는, 각질이 높은 팽창 영역에 표현 15 (K15)입니다. 지난 10 년 HFSCs 및 선조 세포의 여러 가지 다른 별개 집단은 또한 HF ^17,20-27 내에 상주하는 것으로보고되었다.

HFSCs의 또 다른 흥미로운 기능은 피부 복구에 기여한다. 정상적인 조건에서 HFSCs는 HF를 보충하고 IFE 항상성에 참여하지 않습니다. 하우버전은 상처에 대한 응답으로,이 세포는 IFE ^(9)를 다시 채우기 자신의 SC 틈새 및 지원을 종료합니다. 우리는 최근 마우스는 프로 세포 사멸 Sept4 / 예술 유전자 표시 세포 사멸에 저항을 보여 CD34, K15 및 Sox9 ⁺ HFSCs의 증가 수를 삭제할 것을 증명하고있다. HFSCs는 Sept4 / 예술에서 고립되었다 ^{– / –} 등의 스킨 정렬 형광 활성 셀 (FACS)를 이용하고 CD34 ⁺ 및 K15 ⁺ HFSCs의 수보다 두 배 증가가 발생했습니다. 이러한 Sept4 / 예술 ^{– / –} HFSCs 시험 관내에서 팽창되지 않은 콜로니는 더 초래했다하지만 컨트롤 ^(28)에 비하여도 가혹한 조건을 견딜 수 있었다.

HFSCs의 증가를 갖는 결과, Sept4 / 예술 ^{– / –} 마우스의 피부 적출 부상에 응답 훨씬 빠르게 치유. 놀랍게도, Sept4 / 예술 ^{– / –} 마우스는 displaye상처 침대에서 재생 모발, 상당히 작은 상처 다 많은 수의. 또한, XIAP (세포 사멸의 X-연결 억제제), 예술의 생화학 적 대상에 대한 삭제 마우스는 장애 치유 ^(28)을 보여 주었다.

우리의 결과와 다른 실험실에서 수행 한 작업은 HFSCs 성인 희주의 생물학 및 기능 연구를위한 이상적인 모델이 될 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 농축 및 HFSCs 네 마커의 발현에 따라 표피 각질 세포의 분리를위한 방법론에 대해 설명합니다 인테그린 α6을; 인테그린 β1; SCA-1 (표피 각질 세포 마커) 및 CD34. K15 ⁺ HFSCs 유사한 격리도 K15-GFP 리포터 마우스 ^(19)를 사용하여 수행 될 수있다.

Protocol

이 연구는 건강의 이스라엘 교육부의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설명 된 권장 사항을 엄격히 준수 하였다. 동물의 모든 승인 된 기관 동물 관리 프로토콜 기술의 테크 니온 이스라엘 연구소의 IL-02302-2015에 따라 처리 하였다. 1. 실험 준비 킬레이트 태아 소 혈청의 제조 참고 : 칼슘이 세포의 노출을 제어하는​​ 것이 중요하므로 상피 세포 칼슘?…

Representative Results

이 프로토콜 상세 및 농축 개체군의 두 종류의 단리 설명. 팽창으로 SC 및 표피 각질 2 프로토콜의 주요 단계들을 도시한다. 다시 팔주 된 마우스의 등쪽에서 제거 피부를 활용, 우리는 HFSCs로 표현되는 CD34 마커를 사용하여 팽창으로 SC를 강화; 및 무서-1, 표피 각질 세포를 라벨. (3) 피부 상피 세포의 α6 + / β1 + 인구 내?…

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 또한 성인 마우스의 등쪽 피부 HFSCs 분리 확립되지만 동일 ^{2,16,23,28,29} 마커의 선택에 기초하여, HF 구조 내의 다른 집단의 분리에 적용 할 수있다. 이 방법은 조직 분리 등의 세포 분리의 다른 방법을 통해, 특히 유리하다, 즉의 특정 세포 유형이 선택 될 수 있으며, 이종의 세포 집단의 혼합물로부터 수확. 또한, 여기에 기재된 방법은 빠르고 안정적​​이며 사용 …

Materials

Isoflurane	Primal Critical Care	66794-017-10
Carbon dioxide	–	–
Electro Shaver	Oster	Golden A5	Shaver from any other company could be used
70% ethanol	Gadot Lab	830000051	96% ehtanol diluted with distilled water
Dissection mat			Dissection tools from any provider can be used
Forceps	Dumont	11251-10	Foreceps from any other company could be used
Scissors	Dumont	14094-11	Scissors from any other company could be used
Needles/Pins	–	–
Scalpel	Albion	10	Ensure that the scalpel has a blunt end
Tissue culture dish 60mm x 15mm	Sigma-Aldrich	CLS430166
PBS	–		In-house PBS without Calcium and Magnesium
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-050-1A	Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly
Pipettes 10ml	Sigma-Aldrich	Corning, 4488
Ice	–	–
50 ml sterie centrifuge tubes	Minplast Ein-shemer	35050-43
70µM Cell strainer	Fisher	22362548
40µM Cell strainer	Fisher	22362549
Staining buffer	–
Centrifuge	Eppendorf 5804 R	5805 000.017
FACS tubes with Cell strainer caps	Falcon	352235
FACS tubes	Falcon	352063
Integrin β1	eBioscience	25-0291	1:400
Integrin α6	eBioscience	15-0495	1:600
Sca I	eBioscience	11-5981	1:200
CD34	eBioscience	9011-0349	1:300
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	50ng/ml
Dry Chelex	BioRad	142-2842
Beaker	Pyrex	–
Distilled H2O	–	–
Stir bar	–	–
NHCl	BioLab	1903059
Fetal bovine serum (FBS)	Beit Haemek Biological Industries	400718	FBS obtained from a different company can be used
1L glass bottle	Ilmabor	Boro 3.3
Bottle top filter	Autofil	1102-RLS