عزل بصيلات الشعر الخلايا الجذعية والخلايا الكيراتينية البشرة من الجلد الظهرية ماوس
Summary
An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.
Abstract
The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.
Introduction
الخلايا الجذعية البالغة (المنبوذة) ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة عن طريق استبدال الخلايا الميتة وإصلاح الأنسجة التالفة على الاصابة. وتعرف هذه المنبوذة من خلال قدرتها على الخضوع المستمر تجديد الذات والتمايز إلى مختلف الأنساب الخلية 1-3. وتشمل أنظمة أفضل درس، التي تعتمد على المنبوذة الكبار للتجديد، ونظام المكونة للدم، والأمعاء والجلد 1،2،4.
خلال مرحلة التطور الجنيني، ويبدأ الجلد وطبقة واحدة من خلايا البشرة. التشكل من بصيلات الشعر (HF) يبدأ عندما إلى ملء خلايا اللحمة المتوسطة الجلد وتشكل الأدمة الكولاجينية الكامنة 5. المتخصصة خلايا اللحمة المتوسطة، التي تشكل في وقت لاحق حليمة الجلد (DP)، وتنظيم مباشرة تحت طبقة البشرة وتحفيز ظهارة لتشكيل اللوحاءات الشعر التي تبدأ في النمو إلى أسفل 6. المتكاثرة غاية خلايا المصفوفة، وتقع في الجزء السفلي من HF،المغلف هذه الخلايا الوسيطة وتشكيل لمبة الشعر، في حين تبدأ الطبقة الداخلية على التمايز إلى اسطوانات متحدة المركز لتشكيل عمود الشعر (HS) والمحيطة غمد الجذر الداخلية (IRS) 2،3.
في الحياة بعد الولادة وتتألف البشرة البشرة من ثلاث مقصورات: البشرة البيني (IFE)، والغدد الدهنية (SG) وHF. وعلى النقيض من IFE وسان جرمان والتي هي في حالة دائمة من التوازن، وHF هي عملية ديناميكية مصغرة الجهاز الذي يخضع لدورات مستمرة من النمو (طور التنامي) وتدمير (فترة التراجع) وبقية (تساقط الشعر) 4،7. الخلايا الجذعية بصيلات الشعر (HFSCs) التي تغذي هذه الدورة الدائبة، يقيمون في محراب متخصصة داخل HF المعروفة باسم انتفاخ 4. خلال التنامي في HFSCs الخروج من انتفاخ، في أعقاب إشارات التنشيط من موانئ دبي، تبدأ المتكاثرة وتنحدر إلى الأسفل وبالتالي خلق درب خطي طويل من الخلايا المعروفة باسم غمد الجذر الخارجي (ORS) 8-10. خلايا المصفوفة، التيتحيط موانئ دبي في قاعدة HF، دورة بسرعة ويتجه للأعلى تمر التمايز محطة بالتالي توليد HS ومصلحة الضرائب 10 (الشكل 1). مدة طور التنامي يحدد طول الشعر وتعتمد على قدرة التكاثري وتمايز الخلايا مصفوفة 6. عندما يدخل HF فترة التراجع، وخلايا مصفوفة العبور تضخيم في وقف لمبة لتتكاثر، الخضوع لموت الخلايا المبرمج وتتراجع تماما في حين سحب موانئ دبي إلى أعلى حتى يصل إلى جزء غير ركوب الدراجات للHF 8،11. خلال هذا التراجع في HF تشكل بنية مؤقتة تعرف حبلا طلائي، الذي هو سمة من فترة التراجع، ويحتوي على العديد من الخلايا أفكارك. في الفئران، فترة التراجع يدوم بين 3-4 أيام وتتم مزامنة للغاية في دورة الشعر الأولى. عندما تصل إلى HF تساقط الشعر كل HFSCs تصبح هادئة. وتتميز مراحل متميزة من دورة HF أيضا بالتغيرات التي تطرأ على لون الجلد الماوس، نظرا إلى mإنتاج elanin. التغيرات الجلدية من الأسود خلال طور التنامي إلى الرمادي الداكن خلال فترة التراجع إلى الوردي أثناء تساقط الشعر 6،7،12،13.
الشكل 1: دورة الشعر المسام. يتكون HF من الجزء العلوي دائم وإعادة عرض أقل باستمرار، وركوب الدراجات الجزء الذي يخضع لدورات مستمرة من النمو السريع (طور التنامي) وتدمير (فترة التراجع) ومرحلة هدوء نسبي أو الراحة (في طور الراحة). الرجاء النقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
وقد تم التعرف على المنبوذة الحفاظ على HF في البداية باستخدام التجارب مطاردة، مع الثيميدين معالج بالتريتيوم، كشفت عن وجود سكان بطيئة الدراجات التسمية خلايا الاحتفاظ (LRC) أن يقيمون في منطقة الدائمة للHF أقل بقليل من سان جرمان 14. التقدم في HFSCكشفت توصيف عدد قليل من علامات التي يمكن استخدامها لتحديد وعزل المنبوذة محددة من مكانة HF 15. ولعل أفضل علامة للحصول على إثراء HFSCs هي CD34، علامة سطح الخلية التي تم تحديدها أيضا كعلامة SC المكونة للدم في البشر 16. وفي هذا CD34 + الشعبين السكان متميزة كما تم عزل استنادا α6 إنتغرين التعبير 2. علامة أخرى هي الكيراتين 15 (K15) وهو ما يعبر عنه بشكل كبير في المنطقة انتفاخ، وشارك في يموضع مع التعبير CD34، ويستخدم مروج K15 لاستهداف وعزل HFSCs في الحيوانات المعدلة وراثيا 15،17-19. في العقد الماضي، كما تم الإبلاغ عن العديد من السكان متميزة أخرى من HFSCs والخلايا الاصلية في الإقامة داخل HF 17،20-27.
ميزة مثيرة إضافية من HFSCs هي مساهمتها في ترميم الجلد. في ظل ظروف طبيعية HFSCs تجديد HF ولا يشاركون في IFE التوازن. هاوالاصدار، ردا على إصابة هذه الخلايا خروج المتخصصة SC والمساعدات في إعادة إسكانها في IFE 9. لقد أثبتت مؤخرا أن الفئران حذفها لعرض Sept4 / الفنون الجينات الموالية لأفكارك زيادة عدد CD34، K15 وSox9 + HFSCs، التي تدل على مقاومة الخلايا. تم عزل HFSCs من Sept4 / فنون – / – جلود الظهرية باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS)، وكان هناك أكثر من اثنين أضعاف في عدد من CD34 + وK15 + HFSCs. هذه Sept4 / فنون – / – تم توسيع HFSCs في المختبر وليس فقط أعطى ستؤدي إلى مزيد من المستعمرات ولكن كانت أيضا قادرة على تحمل الظروف أقسى مقارنة بمجموعة التحكم 28.
نتيجة وجود عدد متزايد من HFSCs، Sept4 / فنون – / – تلتئم الفئران بشكل أسرع في الاستجابة إلى وقوع إصابات استئصال الجلد. لافت للنظر، Sept4 / فنون – / – الفئران displayeدا عدد كبير من اسر مجدد من السرير الجرح، وندوب أصغر بكثير. وعلاوة على ذلك، أظهرت الفئران المحذوفة لXIAP (العاشر مرتبطة المانع من موت الخلايا المبرمج)، والهدف الكيمياء الحيوية من الفنون، وتضميد الجراح ضعف 28.
وقد أظهرت نتائجنا والعمل المنجز في غيرها من المختبرات التي HFSCs بمثابة نموذج مثالي لدراسة علم الأحياء وظيفة المنبوذة الكبار. هنا، نحن تصف منهجية لتخصيب اليورانيوم وعزل HFSCs والخلايا الكيراتينية البشرة على أساس التعبير عن أربع علامات: α6 إنتغرين. β1 إنتغرين. هيئة السلع التموينية 1 (أ علامة للحصول على الخلايا الكيراتينية البشرة) وCD34. العزلة مماثلة K15 + HFSCs كما يمكن تنفيذها باستخدام K15-GFP مراسل الماوس 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا راسخة لعزل HFSCs من الجلد الظهري للفئران بالغة ولكن يمكن أن تطبق بالتساوي لعزل السكان الآخرين داخل بنية HF، استنادا إلى التحديد من علامات 2،16،23،28،29. هذا الأسلوب هو خصوصا مفيد أكثر من غيرها من أساليب عزل الخلايا، مثل التفكك الأنسجة، في أن نوع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.
Materials
| Isoflurane | Primal Critical Care | 66794-017-10 | |
| Carbon dioxide | – | – | |
| Electro Shaver | Oster | Golden A5 | Shaver from any other company could be used |
| 70% ethanol | Gadot Lab | 830000051 | 96% ehtanol diluted with distilled water |
| Dissection mat | Dissection tools from any provider can be used | ||
| Forceps | Dumont | 11251-10 | Foreceps from any other company could be used |
| Scissors | Dumont | 14094-11 | Scissors from any other company could be used |
| Needles/Pins | – | – | |
| Scalpel | Albion | 10 | Ensure that the scalpel has a blunt end |
| Tissue culture dish 60mm x 15mm | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| PBS | – | In-house PBS without Calcium and Magnesium | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-050-1A | Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly |
| Pipettes 10ml | Sigma-Aldrich | Corning, 4488 | |
| Ice | – | – | |
| 50 ml sterie centrifuge tubes | Minplast Ein-shemer | 35050-43 | |
| 70µM Cell strainer | Fisher | 22362548 | |
| 40µM Cell strainer | Fisher | 22362549 | |
| Staining buffer | – | ||
| Centrifuge | Eppendorf 5804 R | 5805 000.017 | |
| FACS tubes with Cell strainer caps | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes | Falcon | 352063 | |
| Integrin β1 | eBioscience | 25-0291 | 1:400 |
| Integrin α6 | eBioscience | 15-0495 | 1:600 |
| Sca I | eBioscience | 11-5981 | 1:200 |
| CD34 | eBioscience | 9011-0349 | 1:300 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 50ng/ml |
| Dry Chelex | BioRad | 142-2842 | |
| Beaker | Pyrex | – | |
| Distilled H2O | – | – | |
| Stir bar | – | – | |
| NHCl | BioLab | 1903059 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Beit Haemek Biological Industries | 400718 | FBS obtained from a different company can be used |
| 1L glass bottle | Ilmabor | Boro 3.3 | |
| Bottle top filter | Autofil | 1102-RLS |
References
- Wagers, A. J., Weissman, I. L. Plasticity of adult stem cells. Cell. 116, 639-648 (2004).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, 834-842 (2007).
- Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 103-114 (2012).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 207-217 (2009).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Muller-Rover, S., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol. 117, 3-15 (2001).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5, 267-278 (2009).
- Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-1354 (2005).
- Hsu, Y. C., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Dynamics between stem cells, niche, and progeny in the hair follicle. Cell. 144, 92-105 (2011).
- Fuchs, E. The tortoise and the hair: slow-cycling cells in the stem cell race. Cell. 137, 811-819 (2009).
- Plikus, M. V., Chuong, C. M. Complex hair cycle domain patterns and regenerative hair waves in living rodents. J Invest Dermatol. 128, 1071-1080 (2008).
- Ito, M., Kizawa, K., Hamada, K., Cotsarelis, G. Hair follicle stem cells in the lower bulge form the secondary germ, a biochemically distinct but functionally equivalent progenitor cell population, at the termination of catagen. Differentiation. 72, 548-557 (2004).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Cotsarelis, G. Epithelial stem cells: a folliculocentric view. J Invest Dermatol. 126, 1459-1468 (2006).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. J Invest Dermatol. 120, 501-511 (2003).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Lyle, S., et al. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J Cell Sci. 111 (Pt 21), 3179-3188 (1998).
- Liu, Y., Lyle, S., Yang, Z., Cotsarelis, G. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol. 121, 963-968 (2003).
- Vidal, V. P., et al. Sox9 is essential for outer root sheath differentiation and the formation of the hair stem cell compartment. Curr Biol. 15, 1340-1351 (2005).
- Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
- Nijhof, J. G., et al. The cell-surface marker MTS24 identifies a novel population of follicular keratinocytes with characteristics of progenitor cells. Development. 133, 3027-3037 (2006).
- Jensen, U. B., et al. A distinct population of clonogenic and multipotent murine follicular keratinocytes residing in the upper isthmus. J Cell Sci. 121, 609-617 (2008).
- Jensen, K. B., et al. Lrig1 expression defines a distinct multipotent stem cell population in mammalian epidermis. Cell Stem Cell. 4, 427-439 (2009).
- Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
- Horsley, V., et al. Blimp1 defines a progenitor population that governs cellular input to the sebaceous gland. Cell. 126, 597-609 (2006).
- Goldstein, J., Horsley, V. Home sweet home: skin stem cell niches. Cell Mol Life Sci. 69, 2573-2582 (2012).
- Fuchs, Y., et al. Sept4/ARTS regulates stem cell apoptosis and skin regeneration. Science. 341, 286-289 (2013).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
