Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Summary

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Abstract

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Introduction

Le cellule staminali adulte (SCS) sono essenziali per mantenere l'omeostasi tissutale, sostituendo le cellule che muoiono e riparare tessuti danneggiati su lesioni. Questi SC sono definite dalla loro capacità di subire un continuo auto-rinnovamento e di differenziarsi in varie linee cellulari ^1-3. I sistemi più studiati, che dipendono SCs adulti per il rifornimento, includono il sistema ematopoietico, l'intestino ed il ^1,2,4 pelle.

Durante l'embriogenesi, la pelle inizia come un singolo strato di cellule epidermiche. Morfogenesi del follicolo pilifero (HF) inizia quando le cellule mesenchimali popolano la pelle e formano un sottostante derma collagene ^5. Specializzato cellule mesenchimali, che poi costituiscono la papilla dermica (DP), organizzano direttamente sotto lo strato epidermico e stimolano l'epitelio di formare placodi capelli che iniziano a crescere verso il basso ^6. Altamente cellule proliferanti della matrice, situato nella parte inferiore del HF,busta queste cellule mesenchimali e formare il bulbo pilifero, mentre lo strato interno comincia a differenziarsi in cilindri concentrici per formare il fusto del capello (HS) e nelle vicinanze della guaina interna della radice (IRS) ^2,3.

Nella vita postnatale l'epidermide della pelle è composta da tre vani: l'epidermide interfollicolare (IFE), la ghiandola sebacea (SG) e l'HF. In contrasto con la IFE e SG che sono in un costante stato di omeostasi, l'HF è un mini-organo dinamico che subisce continui cicli di crescita (anagen), la distruzione (catagen) e di riposo (telogen) ^4,7. Le cellule staminali del follicolo pilifero (HFSCs) che il carburante questo ciclo perpetuo, risiedono in una nicchia specializzata all'interno della HF conosciuto come il rigonfiamento ^4. Durante anagen i HFSCs uscire dal rigonfiamento, a seguito di segnali di attivazione dal DP, iniziare proliferare e scendere verso il basso creando così una lunga scia lineare di cellule conosciute come la guaina esterna radice (ORS) ^8-10. Le celle di matrice, checircondare il DP alla base della HF, rapidamente ciclo e migrare verso l'alto subire differenziazione terminale generando l'HS e l'IRS ¹⁰ (Figura 1). La durata di anagen determina la lunghezza dei capelli e dipende dalla capacità proliferativa e la differenziazione delle cellule della matrice ^6. Quando l'HF entra catagen, le celle di matrice transito di amplificazione nel bulbo cessano di proliferare, apoptosi e regrediscono completamente tirando la DP verso l'alto fino a raggiungere la parte non bicicletta della HF ^8,11. Durante questa retrazione HF forma una struttura temporanea noto come il filamento epiteliale, che è caratteristica di catagen, e contiene molte cellule apoptotiche. Nei topi, catagen dura tra 3-4 giorni ed è altamente sincronizzato nel primo ciclo del capello. Quando la HF raggiunge telogen tutti HFSCs diventano quiescenti. Le fasi distinte del ciclo HF sono inoltre caratterizzati da cambiamenti nel colore della pelle del topo causa mla produzione elanin. I cambiamenti della pelle dal nero durante anagen al grigio scuro durante catagen al rosa durante telogen ^6,7,12,13.

Figura 1: Il ciclo dei capelli follicolo. Il HF è composto da una parte superiore permanente e una porzione ciclismo inferiore costantemente rimodellamento che subisce continui cicli di rapida crescita (anagen), la distruzione (catagen) e una fase di quiescenza parente o di riposo (telogen). Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.

SCS mantenendo la HF sono stati inizialmente identificati utilizzando esperimenti Chase, con timidina triziata, che ha rivelato una popolazione di cellule di sostegno etichette ciclismo lento (LRC) che risiedevano nella regione permanente del HF appena sotto la SG ^14. I progressi nella HFSCCaratterizzazione rivelato un piccolo numero di marcatori che possono essere utilizzati per identificare e isolare SCs specifici dalla nicchia HF ^15. Forse il miglior marcatore per l'arricchimento di HFSCs è CD34, un marker superficie cellulare anche identificato come un marcatore SC ematopoietiche negli esseri umani ^16. All'interno di questo CD34 ⁺ popolazioni due distinte popolazioni sono stati anche isolati sulla base di espressione α6 integrina ^2. Un altro indicatore è la cheratina 15 (K15), che è altamente espresso nella regione bulge, co-localizza con espressione CD34 e un promotore K15 viene utilizzato per il targeting e isolare HFSCs in animali transgenici ^15,17-19. Negli ultimi dieci anni sono stati segnalati anche diversi altri distinte popolazioni di HFSCs e cellule progenitrici di risiedere all'interno del HF ^17,20-27.

Una caratteristica interessante aggiuntiva di HFSCs è il loro contributo alla riparazione della pelle. In condizioni normali HFSCs ricostituire l'HF e non prendono parte a IFE omeostasi. However, in risposta a ferita, queste cellule uscire la loro nicchia SC e di aiuto nel ripopolare l'IFE ^9. Abbiamo recentemente dimostrato che i topi cancellati per il display gene Sept4 / ARTS pro-apoptotica un aumento del numero di CD34, K15 e Sox9 ⁺ HFSCs, che dimostrano una resistenza all'apoptosi. HFSCs sono stati isolati da Sept4 / ARTS ^{– / –} pelli dorsali utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e c'era più di due volte maggiore del numero di cellule CD34 ⁺ e K15 ⁺ HFSCs. Questi Sept4 / arte ^{– / –} HFSCs sono state espanse in vitro e non hanno dato luogo a solo più colonie, ma sono stati anche in grado di resistere a condizioni più severe rispetto ai controlli ^28.

Come risultato di avere un maggior numero di HFSCs, Sept4 / arte ^{– / –} mice guarite significativamente più veloce in risposta alle lesioni asportazione della pelle. Sorprendentemente, Sept4 / arte ^{– / –} mice displayeda gran numero di HF rigenerate dal letto della ferita, e cicatrici significativamente più piccoli. Inoltre, i topi cancellati per XIAP (inibitore della X-linked di apoptosi), il target biochimico di ARTI, hanno dimostrato ridotta guarigione ^28.

I nostri risultati e il lavoro svolto in altri laboratori hanno dimostrato che HFSCs servire come un modello ideale per lo studio della biologia e della funzione della SCS adulti. Qui, descriviamo la metodologia per l'arricchimento e l'isolamento di HFSCs e cheratinociti epidermici in base alla espressione di quattro marcatori: α6 integrina; β1 integrine; Sca-1 (un marker per cheratinociti epidermici) e CD34. Isolamento analogo di K15 ⁺ HFSCs può essere eseguita anche con il giornalista del mouse K15-GFP ^19.

Protocol

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio di Ministero della Salute di Israele. Tutti gli animali sono stati trattati secondo il protocollo approvato istituzionale cura degli animali IL-02.302-2015 del Technion Israel Institute of Technology. 1. Preparazione sperimentale Preparazione del chelato siero fetale bovino Nota: Le cellule epiteliali sono molto sensibili al c…

Representative Results

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento e l'isolamento di due tipi di popolazioni:. Rigonfiamento SC e cheratinociti epidermici Figura 2 illustra le principali fasi del protocollo. Utilizzando pelle rimossa dalla dorsale posteriore di 8 settimane di età topi, abbiamo arricchito SC rigonfiamento utilizzando il marcatore CD34, che si esprime solo in HFSCs; e Sca-1, che le etichette cheratinociti epidermici. La figura 3 mostra diver…

Discussion

Il protocollo qui descritto è ben consolidata per isolare HFSCs dalla pelle dorsale di topi adulti, ma può essere ugualmente applicata per l'isolamento di altre popolazioni all'interno della struttura HF, basato sulla selezione dei marcatori ^{2,16,23,28,29.} Questo metodo è notevolmente vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento cellulare, come la dissociazione dei tessuti, dal fatto che un tipo di cellula specifico può essere selezionato e raccolto da una miscela di popolazioni cellulari et…

Materials

Isoflurane	Primal Critical Care	66794-017-10
Carbon dioxide	–	–
Electro Shaver	Oster	Golden A5	Shaver from any other company could be used
70% ethanol	Gadot Lab	830000051	96% ehtanol diluted with distilled water
Dissection mat			Dissection tools from any provider can be used
Forceps	Dumont	11251-10	Foreceps from any other company could be used
Scissors	Dumont	14094-11	Scissors from any other company could be used
Needles/Pins	–	–
Scalpel	Albion	10	Ensure that the scalpel has a blunt end
Tissue culture dish 60mm x 15mm	Sigma-Aldrich	CLS430166
PBS	–		In-house PBS without Calcium and Magnesium
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-050-1A	Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly
Pipettes 10ml	Sigma-Aldrich	Corning, 4488
Ice	–	–
50 ml sterie centrifuge tubes	Minplast Ein-shemer	35050-43
70µM Cell strainer	Fisher	22362548
40µM Cell strainer	Fisher	22362549
Staining buffer	–
Centrifuge	Eppendorf 5804 R	5805 000.017
FACS tubes with Cell strainer caps	Falcon	352235
FACS tubes	Falcon	352063
Integrin β1	eBioscience	25-0291	1:400
Integrin α6	eBioscience	15-0495	1:600
Sca I	eBioscience	11-5981	1:200
CD34	eBioscience	9011-0349	1:300
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	50ng/ml
Dry Chelex	BioRad	142-2842
Beaker	Pyrex	–
Distilled H2O	–	–
Stir bar	–	–
NHCl	BioLab	1903059
Fetal bovine serum (FBS)	Beit Haemek Biological Industries	400718	FBS obtained from a different company can be used
1L glass bottle	Ilmabor	Boro 3.3
Bottle top filter	Autofil	1102-RLS