This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Met de snelle ontwikkeling van stamcel-gebaseerde gentherapieën tegen HIV, er dringende taak een diermodel om de hematopoëtische differentiatie en het immuunsysteem van de genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen. Het gehumaniseerde beenmerg / Liver / Thymus (BLT) muismodel maakt volledige reconstructie van een menselijk immuunsysteem in de omtrek, die T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten omvat. De menselijke thymus implantaat worden ook thymus selectie van T-cellen autologe thymusweefsel. Naast de studie van HIV-infectie, het model staat als een krachtig hulpmiddel om differentiatie, ontwikkeling en functionaliteit van cellen afkomstig van hematopoietische stamcellen (HSCs) te bestuderen. Hier beschrijven we de constructie van gehumaniseerde niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ – / -) -Bone merg / Liver / Thymus (NSG-BLT) muizen met HSCs getransduceerd met CD4 chimere antigen receptor (CD4CAR)lentivirus vector. We laten zien dat de CD4CAR HSCs succes kunnen differentiëren in meerdere lijnen en anti-HIV-activiteit. Het doel van de studie is het gebruik van NSG-BLT muismodel als een in vivo model van technisch immuniteit tegen HIV te tonen. Het is vermeldenswaard dat, omdat lentivirus en menselijk weefsel wordt gebruikt, experimenten en operaties moeten worden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid kast in een Biosafety Level 2 (BSL2) met speciale voorzorgsmaatregelen (BSL2 +) faciliteit.
Ondanks het succes van gecombineerde anti-retrovirale therapie, HIV-infectie blijft een levenslange aandoening. De cellulaire immuunrespons tegen HIV speelt zeer belangrijke rol bij de controle van HIV-replicatie. Recente ontwikkelingen in stamcellen manipulatie toegestaan voor de snelle ontwikkeling van gentherapie benaderingen voor behandeling van HIV 1-3. Dientengevolge is het belangrijk om een goede diermodel waarmee in vivo studie van de effectiviteit van celgebaseerde therapieën tegen HIV.
Die met HIV in diermodellen is gecompliceerd door het feit dat het virus infecteert alleen menselijke cellen. Om deze beperking te omzeilen, hebben wetenschappers hun toevlucht tot het gebruik van de ziekte van modellen zoals de Simian Immunodeficiency Virus (SIV) bij Rhesus makaken 4,5. Helaas zijn er grote beperkingen in dit model te wijten aan de inherente verschillen tussen de soorten en de verschillen tussen SIV en HIV. Daarnaast zijn er slechts zeer gespecialiseerde faciliteiten capable ondersteuning van het werk met niet-menselijke primaten en elke makaak vergt een grote investering. Aldus, is er dringend behoefte aan een model dat het menselijke immuunsysteem, dat gevoelig is voor HIV-infectie / pathogenese gebruikt en minder financieel onbetaalbaar.
De niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ – / -) (of NSG) Blood / Liver / Thymus (BLT) gehumaniseerd muismodel steeds bewezen als een belangrijk instrument HIV-infectie te bestuderen. Door het implanteren van hematopoietische stamcellen (HSC) en foetale thymus, de muizen in staat zijn om te ontwikkelen en te herhalen een menselijk immuunsysteem 1-3. Een type stamcel gentherapie behelst 'ombuigen perifere T-cellen targeten HIV door herprogrammering hematopoëtische stamcellen (HSC) te differentiëren tot antigeen-specifieke T-cellen. We hebben eerder aangetoond dat techniek HSCs met een moleculair gekloneerde anti-HIV-specifieke T cel rereceptor (TCR) tegen SL9 epitoop (aminozuren 77-85, SLYNTVATL) van HIV-1 Gag kunnen stamcellen te sturen naar de vorming van rijpe T-cellen die HIV replicatie in de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel 6 onderdrukken. Het nadeel van het gebruik van een moleculair gekloneerd TCR is dat het beperkt is tot een specifiek humaan leukocyt antigeen (HLA) subtype dat de toepassing van deze therapie wordt beperkt. Chimere antigeenreceptoren (CAR), anderzijds, kan universeel toegepast op alle HLA-subtypes. Initiële studies werden uitgevoerd onder toepassing van een CAR geconstrueerd met de extracellulaire en transmembrane domeinen van humaan CD4 gefuseerd aan het intracellulaire signalering ζ domein van CD3 (aangeduid als de CD4ζCAR). CD4ζCAR expressie op CD8 T-cellen kunnen herkennen HIV envelop en leiden tot een cytotoxische T-celreactie die vergelijkbaar is met die gemedieerd wordt door een T-celreceptor 7. We hebben onlangs aangetoond dat humane HSCs instelbaar onder CD4ζCAR, die vervolgens kunnen differentiëren in verschillende hematopoietische lineages, waaronder functionele T-cellen kunnen onderdrukken HIV replicatie in de gehumaniseerd muismodel 8. Met de snelle vooruitgang in chimeer antigen receptor therapieën voor kanker 9 en de verdere karakterisering van potente breed neutraliserende antilichamen tegen HIV 10-12 dat de constructie van enkelketenige antilichamen CARs mogelijk is waarneembaar dat vele nieuwe kandidaat constructen naast CD4ζCAR , wordt gegenereerd en getest op stamcel gebaseerde gentherapie van HIV ziekten en andere ziekten. Daarnaast kan de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel die deze antigeen-specifieke voertuigen ook een nuttig instrument een grondig onderzoek in de humane T cel responsen in vivo. Belangrijker ons protocol verschilt van eerdere werkwijzen beschreven voor de constructie van gehumaniseerde van BLT muizen 13-15, dat de HSCs in gelatineuze eiwitmengsel wordt gebruikt in plaats van foetale lever stammen 16. Dit protocol beschrijft: 1) de bouw van humanized BLT gemanipuleerde muizen met CD4ζCAR; en 2) karakterisering van de differentiatie van de genetisch gemodificeerde cellen; en 3) karakterisering van de functionaliteit van de genetisch gemodificeerde cellen.
Met CAR en HSC-gebaseerde engineered immuniteit stroomversnelling naar klinische studies, is het belangrijk om een goede diermodel zorgvuldig worden afgewogen differentiatie en functie van deze gemanipuleerde cellen. In dit protocol beschrijven we de methoden voor de bouw en het testen van vermenselijkte muizen met genetisch gemodificeerde stamcellen engineered tegen HIV. Het is belangrijk om efficiënte transductie van stamcellen voorafgaand aan transplantatie. Vanwege het vermogen van T-cellen te prolifereren bi…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |