Стволовых клеток На основе Engineered иммунитет против ВИЧ-инфекции в модели Гуманизированные мыши
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
С быстрым развитием генной терапии на основе стволовых клеток против ВИЧ, существует требование для прессования животной модели для изучения дифференцировки гемопоэтических и иммунной функции генетически модифицированных клеток. Гуманизированное костного мозга / печени / Тимус (BLT) Мышиная модель позволяет полное воссоздание человеческой иммунной системы на периферии, которая включает в себя Т-лимфоциты, В-лимфоциты, клетки NK и моноцитов. Тимуса имплантат человека также позволяет тимуса селекции Т-клеток в аутогенной тимуса ткани. В дополнение к изучению ВИЧ-инфекции, модель выступает в качестве мощного инструмента для изучения дифференциации, развитие и функциональные возможности клеток, полученных из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Здесь мы наметим строительство гуманизированного не страдающих ожирением диабетической (NOD) -severe комбинированным иммунодефицитом (SCID) -Общие гамма – цепи нокаута (с = Г – / -) мышей -Bone мозга / печени / тимус (NSG-BLT) с ГСК трансдуцированных с CD4 химерного рецептора антигена (CD4CAR)лентивирусов вектор. Покажем, что CD4CAR ГСК могут успешно дифференцироваться в множественные клоны и обладают активностью против ВИЧ. Цель исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать использование NSG-BLT модели мыши в качестве модели в естественных условиях для сконструированного иммунитета против ВИЧ. Стоит отметить, что, так как лентивирусов и ткани человека используется, эксперименты и операции должны быть выполнены в шкафу II класса биологической безопасности в биологической безопасности 2-го уровня (BSL2) с соблюдением специальных мер предосторожности (BSL2 +) объекта.
Introduction
Несмотря на успех комбинированной антиретровирусной терапии, ВИЧ-инфекция по-прежнему является пожизненное заболевание. Клеточный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции играет чрезвычайно важную роль в борьбе с ВИЧ-репликации. Последние достижения в области манипулирования стволовых клеток позволило для быстрого развития генной терапии подходы к лечению ВИЧ – 1-3. В результате, важно иметь надлежащую животную модель , которая позволяет в естественных условиях исследования эффективности клеточной терапии против ВИЧ.
Работа с ВИЧ, в моделях на животных осложняется тем фактом, что вирус заражает только клетки человека. Чтобы обойти это ограничение, ученые прибегают к использованию модели заболеваний , как вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) в макак – резусов 4,5. К сожалению, существуют серьезные ограничения в этой модели из-за присущей различий между видами и различия между SIV и ВИЧ. Кроме того, только узкоспециализированные объекты являются сapable поддерживать работу с приматами нечеловеческих и каждого макаки требует больших инвестиций. Таким образом, существует настоятельная потребность в модели, которая использует иммунную систему человека, которая восприимчивы к ВИЧ-инфекции / патогенеза, и менее финансово непомерно высокой.
Без ожирения диабетические (NOD) -severe комбинированным иммунодефицитом (SCID) -Общие гамма – цепи нокаута (с γ – / -) (или NSG) Кровь / Печень / тимус (BLT) модель гуманизированное мышь все более доказал, что является важным инструментом для изучения ВИЧ-инфекции. Имплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и фетальной вилочковой железы мышей способны развиваться и резюмировать человека иммунную систему 1-3. Один тип генной терапии, основанной стволовых клеток включает в себя «перенаправлять» периферических Т-клеток целевой ВИЧ путем перепрограммирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) к дифференцировке в антиген-специфических Т-клеток. Ранее мы показали, что инженерные ГСК с молекулярным клонированного анти-ВИЧ-специфических Т-клеток ререцептор (TCR) по отношению к эпитопу SL9 (аминокислоты 77-85; SLYNTVATL) ВИЧ-1 Gag может переадресовать стволовых клеток в формировании зрелых Т – клеток , которые подавляют репликацию ВИЧ в гуманизированного NSG-BLT модели мыши 6. Оговоркой использования молекулярного клонированный TCR, что оно ограничено конкретным человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) подтипа, которые ограничивают применение этой терапии. Химерный антиген рецепторов (CAR), с другой стороны, может быть универсально применен ко всем подтипам HLA. Первоначальные исследования были проведены с использованием CAR, построенную с внеклеточных и трансмембранных доменов человеческого CD4, слитого с внутриклеточным z, домен CD3 сигнализации (называется CD4ζCAR). CD4ζCAR экспрессируются на клетках CD8 Т – могут распознавать оболочку ВИЧ и вызывают цитотоксических Т – клеточный ответ , который похож на что опосредовано Т – клеточного рецептора 7. Недавно мы показали, что человеческие гемопоэтические стволовые клетки могут быть модифицированы с CD4ζCAR, которые затем могут дифференцироваться во множественные кроветворной Lineages, в том числе функциональные Т – клетки способны подавлять репликацию ВИЧ в гуманизированные модели мыши 8. В связи с быстрым продвижением в химерных терапии рецептора антигена рака 9, и продолжающейся характеризации мощных широких нейтрализующих антител 10-12 против ВИЧ , которые позволяют строительство CARs антител одноцепочечных, то воспринимаемое , что многие новые кандидаты конструкции, в дополнение к CD4ζCAR , будет сгенерирован и испытаны для стволовых клеток генной терапии заболеваний ВИЧ и других заболеваний на основе. Кроме того, гуманизированное мышиная модель NSG-BLT , содержащие эти антиген-специфические КДК может также служить полезным инструментом внимательно изучить Т – клеточные ответы человека в естественных условиях. Важно отметить, что наш протокол отличается от предыдущих описанных методов построения гуманизированным из BLT мышей в 13-15 , что гемопоэтические стволовые клетки в желатиновой белковой смеси используют вместо эмбриональных стволах 16 с печенью. Этот протокол описывает: 1) построение HumaniZed BLT мышей сконструированные с CD4ζCAR; и 2) характеристика дифференциации генетически модифицированных клеток; и 3) характеристика функциональности генетически модифицированных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
С CAR и HSC на основе инженерии иммунитета набирает обороты в направлении клинических исследований, важно иметь подходящую модель животного, чтобы внимательно изучить дифференцировку и функции этих сконструированных клетках. В этом протоколе мы описали методы построения и тестирования…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
