Cellule staminali base Immunità Engineered contro l'infezione da HIV nel modello umanizzato mouse
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Con il rapido sviluppo di terapie geniche a base di cellule staminali contro l'HIV, non vi è necessità di premere un modello animale per studiare la differenziazione ematopoietiche e la funzione immunitaria delle cellule geneticamente modificate. Il umanizzato midollo osseo / Fegato / Thymus (BLT) topo modello consente la piena ricostituzione di un sistema immunitario umano in periferia, che comprende le cellule T, cellule B, cellule NK e monociti. L'impianto del timo umano consente anche per la selezione timica delle cellule T nel tessuto del timo autologo. Oltre allo studio dell'infezione da HIV, il modello rappresenta un potente strumento per studiare la differenziazione, lo sviluppo e la funzionalità delle cellule derivate da cellule staminali ematopoietiche (CSE). Qui descriviamo la costruzione di umanizzato diabetici non obesi (NOD) -Grave combinato immunodeficienti (SCID) -Comune gamma catena knockout (c γ – / -) topo Hong osseo osseo / Fegato / Thymus (NSG-BLT) con CSE trasdotte con CD4 recettore per l'antigene chimerico (CD4CAR)vettore lentivirus. Abbiamo dimostrato che il CD4CAR CSE può differenziarsi con successo in molteplici linee e hanno attività anti-HIV. L'obiettivo dello studio è quello di dimostrare l'uso del modello di topo NSG-BLT come un modello in vivo per l'immunità ingegnerizzato contro l'HIV. Vale la pena notare che, poiché viene utilizzato lentivirus e tessuti umani, esperimenti e interventi chirurgici devono essere eseguiti in una classe II armadio biosicurezza in un livello di biosicurezza 2 (BSL2) con particolari precauzioni (BSL2 +) struttura.
Introduction
Nonostante il successo del combinato terapia anti-retrovirale, l'infezione da HIV è ancora una malattia per tutta la vita. La risposta immunitaria cellulare contro l'HIV gioca un ruolo molto importante nel controllo della replicazione di HIV. I recenti progressi nella manipolazione di cellule staminali ha permesso per il rapido sviluppo di approcci di terapia genica per l'HIV trattamento 1-3. Di conseguenza, è importante avere un modello animale adeguato che permette studio in vivo dell'efficacia di terapie cellulari contro l'HIV.
Utilizzo di HIV in modelli animali è complicata dal fatto che il virus infetta soltanto cellule umane. Per aggirare questa limitazione, gli scienziati hanno fatto ricorso all'utilizzo di modelli di malattia come il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) in Rhesus macachi 4,5. Purtroppo, ci sono importanti limitazioni in questo modello a causa delle differenze intrinseche tra le specie e le differenze tra SIV e HIV. Inoltre, solo i servizi altamente specializzati sono capable di sostenere il lavoro con i primati non umani e ogni macaco richiede un grande investimento. Pertanto, vi è una necessità urgente di un modello che utilizza il sistema immunitario umano, che è suscettibile di infezione HIV / patogenesi, ed è meno proibitivo finanziariamente.
Il diabetici non obesi (NOD) -Grave combinato immunodeficienti (SCID) -Comune gamma catena knockout (c γ – / -) (o NSG) Sangue / Fegato / Thymus (BLT) modello di topo umanizzato è sempre dimostrato di essere uno strumento importante per studiare l'infezione da HIV. Impiantando cellule staminali ematopoietiche (CSE) e del timo fetale, i topi sono in grado di sviluppare e riepilogare un sistema immunitario umano 1-3. Un tipo di terapia genica basata sulle cellule staminali coinvolge 'reindirizzamento' cellule T periferiche di indirizzare l'HIV riprogrammando cellule staminali ematopoietiche (CSE) di differenziarsi in cellule T antigene specifico. Abbiamo dimostrato in precedenza che HSC ingegneria con un molecolare clonato anti-HIV specifica re delle cellule Trecettore (TCR) contro l'epitopo SL9 (aminoacido 77-85; SLYNTVATL) del virus HIV-1 gag può reindirizzare le cellule staminali in formazione di linfociti T maturi che sopprimono la replicazione di HIV nel umanizzato NSG-BLT modello di topo 6. L'avvertimento di utilizzare un TCR clonato molecolare è che è limitato ad uno specifico sottotipo antigene leucocitario umano (HLA) che limitare l'applicazione di questa terapia. recettori chimerici antigene (CAR), d'altro canto, possono essere universalmente applicati a tutti i sottotipi HLA. Gli studi iniziali sono stati eseguiti utilizzando un CAR costruito con i domini extracellulari e transmembrana di CD4 umana fusa alla ζ segnalazione intracellulare dominio di CD3 (definito il CD4ζCAR). CD4ζCAR espresso sulle cellule T CD8 può riconoscere busta HIV e scatenare una risposta delle cellule T citotossiche che è simile a quella mediata da un recettore delle cellule T 7. Abbiamo recentemente dimostrato che cellule staminali emopoietiche umane possono essere modificati con CD4ζCAR, che possono poi differenziarsi in molteplici ematopoietiche Lineages, comprese le cellule T funzionali in grado di sopprimere la replicazione dell'HIV nel modello umanizzato del mouse 8. Con il rapido avanzamento in chimerici terapie recettore antigene per il cancro 9, e la caratterizzazione continuo di potenti ampie anticorpi neutralizzanti 10-12 contro l'HIV che permettono la costruzione di un'unica catena CAR anticorpi, è percepibile che molti nuovi costrutti candidati, in aggiunta a CD4ζCAR , sarà generato e testato per la terapia genica a base di cellule staminali di malattie HIV e altre malattie. Inoltre, il modello di topo NSG-BLT umanizzato contenente queste vetture antigene-specifiche può anche fornire un utile strumento per esaminare attentamente le risposte delle cellule T umane in vivo. È importante sottolineare che il nostro protocollo differisce dai metodi descritti precedenti per la costruzione di umanizzato di topi BLT 13-15 dal fatto che la CSE in miscela proteica gelatinosa viene utilizzato al posto di tronchi fegato fetale 16. Questo protocollo descrive: 1) costruzione di Humanitopi BLT zed ingegnerizzati con CD4ζCAR; e 2) caratterizzazione del differenziamento delle cellule geneticamente modificate; e 3) caratterizzazione della funzionalità delle cellule geneticamente modificate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con l'automobile e HSC-based immunità ingegnerizzato acquistando slancio verso gli studi clinici, è importante avere un modello animale adeguato per esaminare da vicino la differenziazione e la funzione di queste cellule ingegnerizzate. In questo protocollo abbiamo descritto i metodi per costruire e testare i topi umanizzati con cellule staminali geneticamente modificate ingegnerizzate contro l'HIV. E 'importante avere efficiente trasduzione di cellule staminali prima del trapianto. Tuttavia, a causa della…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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