인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
HIV에 대한 줄기 세포 기반 유전자 요법의 급속한 발전으로, 유전자 변형 세포의 조혈 및 분화 면역 기능을 연구하기위한 동물 모델에 대한 요구 사항을 가압있다. 인간화 뼈 골수 / 간장 / 흉선 (BLT) 마우스 모델은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하는 주변의 인간 면역 시스템의 전체 재구성을 허용한다. 인간의 흉선 이식은자가 흉선 조직에서 T 세포의 흉선 선택할 수 있습니다. HIV 감염의 연구 이외에도, 모델은 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)에서 유래 된 세포의 분화, 발달 및 기능을 연구하기위한 강력한 도구로 나타낸다. 형질 도입 조혈 모세포와 -Bone 골수 / 간 / 흉선 (NSG-BLT) 마우스 여기에 우리가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- – / C γ)를 -severe 인간화 비 비만 당뇨병 (NOD)의 건설 개요 CD4 키메라 항원 수용체와 (CD4CAR)렌티 바이러스 벡터입니다. 우리는 CD4CAR 조혈 성공적 다중 계통으로 분화, 항 HIV 활성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. 이 연구의 목적은 HIV에 대한 면역 설계에 대한 생체 내 모델로서 NSG-BLT 마우스 모델의 사용을 설명한다. 그것은 렌티 바이러스와 인체 조직이 사용되기 때문에, 실험과 수술이 특별한주의 (BSL2의 +) 설비와 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)에 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야하는 것이 주목할 가치가있다.
Introduction
조합 된 항 – 레트로 바이러스 요법의 성공에도 불구하고 HIV 감염은 여전히 평생 질환이다. HIV에 대하여 세포 성 면역 반응은 HIV 복제를 조절하는데 매우 중요한 역할을한다. 줄기 세포 조작에서의 최근 발전은 HIV 치료 1-3 유전자 치료 접근의 급속한 발전을 허용했다. 그 결과, HIV에 대한 세포 – 기반 치료법의 효능의 생체 내 연구에 있도록 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다.
동물 모델에서 작업하는 HIV 바이러스는 인간 세포를 감염한다는 사실에 의해 복잡하게된다. 이러한 제한을 피하기 위해, 과학자들은 붉은 털 원숭이에서 4,5- 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)과 같은 질병 모델을 사용하는 것에 의존하고있다. 불행하게도 인해 종에 걸쳐 고유 차이와 SIV와 HIV 사이의 차이점이 모델의 주요 제한 사항이 있습니다. 또한, 단지 고도로 전문화 된 시설은 C는인간이 아닌 영장류 각각의 원숭이와 함께 작업을 지원 apable 큰 투자를 필요로한다. 따라서, HIV 감염 / 발병되기 쉽다 인간의 면역 시스템을 이용하여, 적은 경제적 금지하는 모델에 대한 가압이 필요하다.
(또는 NSG) 혈액 / 간 / 흉선 (BLT) 인간화 된 마우스 모델은 점점 입증하는 중요한 도구 비 비만 당뇨병 (NOD)가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- – / C γ)를 -severe HIV 감염을 연구합니다. 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 태아 흉선을 주입함으로써, 마우스 개발 인간 면역계 1-3 요점을 되풀이 할 수있다. 줄기 세포 기반 유전자 치료제의 한 종류는 항원 특이 T 세포로 분화하는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)를 재 프로그래밍함으로써 HIV를 타겟팅 말초 T 세포를 '재지'포함한다. 우리는 이전에 도시했는지 분자 클로닝 된 항 HIV 특이 T 세포와 재 설계 조혈SL9 에피토프 (아미노산 77-85; SLYNTVATL) 대 ceptor (TCR) HIV-1 개그는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델 6에서 HIV 복제를 억제하는 성숙한 T 세포 형성에 줄기 세포를 리다이렉트 할 수있다. 분자 클로닝 TCR 사용의 경고는이 치료의 적용을 제한하는 특정 인간 백혈구 항원 (HLA) 서브 타입으로 제한된다는 것이다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 반면, 보편적 모두 HLA 서브 타입에 적용될 수있다. 초기 연구는 CD3의 도메인 신호 세포 내 ζ에 융합 된 인간 CD4의 세포 외 및 횡단 도메인으로 구성된 자동차를 이용하여 수행 하였다합니다 (CD4ζCAR 불린다). CD4ζCAR는 HIV 엔벨로프를 인정하고, T 세포 수용체 (7)에 의해 매개되는 것과 유사한 세포 독성 T 세포 반응을 유발할 수 CD8 T 세포에서 발현. 우리는 최근 인간의 조혈 모세포가 다음 여러 조혈 리로 분화 할 수 CD4ζCAR으로 수정 될 수 있음을 증명하고있다인간형 마우스 모델 8에서 HIV 복제를 억제 할 수있는 작용 성 T 세포를 포함 neages. 암 9 키메라 항원 수용체 치료의 급속한 발전, 그리고 강력한 광범위 중화 항체 단일 사슬 항체 자동차의 건설을 허용 HIV에 대한 10-12의 지속적인 특성, 그것은인지 CD4ζCAR 외에도 많은 새로운 후보의 구조이며, 생성 및 HIV 질환 및 기타 질환의 줄기 세포 기반 유전자 치료에 대해 시험한다. 또한, 이러한 항원 특이 차량을 포함하는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델은 밀접하게 생체 내에서 인간 T 세포 반응을 조사하기 위해 유용한 도구를 제공 할 수있다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 BLT 마우스 그 조혈 모세포는 젤라틴 단백질 혼합물에서 태아 간 트렁크 (16) 대신에 사용됩니다에서 13-15의 인간화의 건설 이전에 기술 된 방법과 다릅니다. 이 프로토콜은 설명 humani 1) 건설CD4ζCAR으로 설계 평탄화 BLT 마우스; 2) 유전자 변형 세포의 분화의 특성화; 유 전적으로 변형 된 세포 기능, 3) 특성화.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAR 및 임상 연구 향해 HSC 기반 설계 내성 획득 모멘텀 밀접 설계된 세포 분화 및 기능을 검토하기위한 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에서 우리는 건설 및 HIV에 대한 설계 유 전적으로 변형 된 줄기 세포와 인간화 된 쥐를 시험하기위한 방법을 설명했다. 이식 전에 줄기 세포의 효율적인 전달을하는 것이 중요합니다. 그러나, 표적 세포의 인식에 따라 증식하는 T 세포의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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