Stem-celle Baseret Udviklet immunitet mod HIV-infektion i humaniseret musemodel
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Med den hurtige udvikling af stamcelle-baserede genterapier mod HIV, der er presserende behov for en dyremodel til at undersøge hæmatopoietisk differentiering og immunfunktion af de genetisk modificerede celler. Det humaniserede Knoglemarv / Liver / Thymus (BLT) musemodel giver mulighed for fuld rekonstituering af et humant immunsystem i periferien, som omfatter T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter. Den humane thymisk implantat giver også mulighed for thymisk udvælgelse af T-celler i autolog thymisk væv. Ud over studiet af HIV-infektion, modellen står som et kraftfuldt værktøj til at studere differentiering, udvikling og funktionaliteten af celler afledt fra hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Her har vi skitsere konstruktionen af humaniseret ikke-obese diabetiske (NOD) -Hårdt kombineret immundefekt (SCID) -Fælles gamma-kæde knockout (c γ – / -) -Bone-marv / Liver / Thymus (NSG-BLT) mus med HSC'er transducerede med CD4 kimært antigen receptor (CD4CAR)lentivirusvektor. Vi viser, at CD4CAR HSC'er succes kan differentiere til flere slægter og har anti-HIV-aktivitet. Målet med undersøgelsen er at demonstrere brugen af NSG-BLT musemodel som en in vivo model for manipuleret immunitet mod HIV. Det er værd at bemærke, at fordi lentivirus og humant væv anvendes, bør udføres eksperimenter og operationer i en klasse II biosikkerhed kabinet i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) med særlige forholdsregler (BSL2 +) facilitet.
Introduction
Trods succes kombineret anti-retroviral terapi, HIV-infektion er stadig en livslang sygdom. Det cellulære immunrespons mod HIV spiller meget vigtig rolle i at kontrollere HIV-replikation. Nylige fremskridt i stamceller manipulation har tilladt for den hurtige udvikling af genterapi tilgange til HIV-behandling 1-3. Som følge heraf er det vigtigt at have en ordentlig dyremodel, der tillader in vivo-undersøgelse af effektiviteten af cellebaserede behandlingsformer mod HIV.
Arbejde med HIV i dyremodeller kompliceres af det faktum, at virussen inficerer kun humane celler. For at omgå denne begrænsning, har forskerne tyet til at bruge sygdomsmodeller som Simian Immunodeficiency Virus (SIV) i Rhesus makakaber 4,5. Desværre er der store begrænsninger i denne model på grund af de iboende forskelle på tværs af arter og forskellene mellem SIV og HIV. Derudover kun højt specialiserede faciliteter er capable at støtte arbejdet med primater og hver makak kræver en stor investering. Således er der et presserende behov for en model, der udnytter det humane immunsystem, som er modtagelige for HIV-infektion / patogenese, og er mindre økonomisk prohibitiv.
Den ikke-fede diabetiske (NOD) -Hårdt kombineret immundefekt (SCID) -Fælles gamma kæde knockout (c γ – / -) (eller NSG) Blood / Lever / Thymus (BLT) humaniseret musemodel i stigende grad vist sig at være et vigtigt redskab at studere HIV-infektion. Ved at implantere hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) og føtal thymus, musene kan udvikle og rekapitulere et humant immunsystem 1-3. En type stamcelle baseret genterapi involverer "omdirigere" perifere T-celler til at målrette HIV ved omprogrammering hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) til at differentiere til antigenspecifikke T-celler. Vi har tidligere vist, at tekniske HSC'er med en molekylær klonet anti-HIV-specifik T-celle receptor (TCR) mod SL9 epitop (aminosyre 77-85; SLYNTVATL) af HIV-1 Gag kan omdirigere stamceller til dannelse modne T-celler, der undertrykker HIV-replikation i det humaniserede NSG-BLT musemodel 6. Det forbehold af anvendelse af en molekylær klonet TCR er, at det er begrænset til en specifik human leukocyt antigen (HLA) subtype, der vil begrænse anvendelsen af denne terapi. Kimære antigen-receptorer (CAR), på den anden side, kan anvendes universelt til alle HLA-undertyper. Indledende undersøgelser blev udført under anvendelse af en CAR konstrueret med de ekstracellulære og transmembrane domæner af humant CD4 fusioneret til det intracellulære ζ signalering domæne af CD3 (betegnet CD4ζCAR). CD4ζCAR udtrykt på CD8 T-celler kan genkende HIV envelope og udløse et cytotoksisk T-celle-respons, der svarer til den medieres af en T-cellereceptor 7. Vi har for nylig vist, at humane HSC'er kan modificeres med CD4ζCAR, som derefter kan differentiere til flere hæmatopoietisk lineages, herunder funktionelle T-celler kan undertrykke HIV-replikation i den humaniserede musemodel 8. Med den hurtige fremgang i kimære antigen receptor terapier for cancer 9, og den igangværende karakterisering af potente brede neutraliserende antistoffer mod HIV 10-12, der tillader konstruktionen af enkeltkædet antistof biler, er det opfattes, at mange nye kandidat konstruktioner, foruden CD4ζCAR vil genereres og testes for stamceller baseret genterapi af HIV-sygdomme og andre sygdomme. Desuden kan den humaniseret NSG-BLT musemodel indeholder disse antigen-specifikke CARs også et nyttigt redskab til nøje at undersøge de menneskelige T-celle responser in vivo. Vigtigere er det, vores protokol adskiller sig fra tidligere beskrevne fremgangsmåder til konstruktion af humaniseret af BLT mus 13-15 i at HSC'er i gelatinøse protein blanding anvendes i stedet for føtale lever trunks 16. Denne protokol beskriver: 1) opførelse af humanized BLT mus manipuleret med CD4ζCAR; og 2) karakterisering af differentieringen af de genetisk modificerede celler; og 3) karakterisering af funktionaliteten af de genetisk modificerede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med CAR og HSC-baserede manipuleret immunitet vinder momentum i retning af kliniske studier, er det vigtigt at have en ordentlig dyremodel til nøje at undersøge den differentiering og funktion af disse manipulerede celler. I denne protokol beskrev vi de metoder, til at konstruere og teste humaniseret mus med genetisk modificerede stamceller-celler manipuleret mod HIV. Det er vigtigt at have en effektiv transduktion af stamceller før transplantation. Men på grund af evnen hos T-celle til at proliferere efter genkende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
