Humanized माउस मॉडल में एचआईवी संक्रमण के खिलाफ स्टेम सेल आधारित इंजीनियर प्रतिरक्षण
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
एचआईवी के खिलाफ स्टेम सेल आधारित जीन चिकित्सा के तेजी से विकास के साथ, वहाँ hematopoietic भेदभाव और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक पशु मॉडल के लिए आवश्यकता दबाव डाल रहा है। humanized बोन मैरो / जिगर / थाइमस (बीएलटी) माउस मॉडल है जो टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एन.के. कोशिकाओं और monocytes शामिल परिधि में एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली, से भरा पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है। मानव थाइमिक प्रत्यारोपण भी ऑटोलॉगस थाइमिक ऊतकों में टी कोशिकाओं की थाइमिक चयन के लिए अनुमति देता है। एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के अलावा, मॉडल भेदभाव, विकास और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) से ली गई कोशिकाओं की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में खड़ा है। यहाँ हम humanized गैर-मोटे मधुमेह (इशारा) के निर्माण की रूपरेखा तैयार संयुक्त immunodeficient (एस.सी.आई.डी) -common गामा चेन पीटकर (ग γ – / -) -severe transduced एचएससी के साथ -Bone-मज्जा / जिगर / थाइमस (एनएसजी-बीएलटी) चूहों सीडी 4 रिसेप्टर कैमेरिक प्रतिजन के साथ (CD4CAR)lentivirus वेक्टर। हम बताते हैं कि CD4CAR एचएससी सफलतापूर्वक कई प्रजातियों में अंतर और एचआईवी रोधी गतिविधि हो सकती है। अध्ययन के लक्ष्य एचआईवी के खिलाफ इंजीनियर प्रतिरक्षा के लिए एक Vivo में मॉडल के रूप में एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल के उपयोग के प्रदर्शन करने के लिए है। यह ध्यान देने योग्य है कि, क्योंकि lentivirus और मानव ऊतक प्रयोग किया जाता है, प्रयोगों और सर्जरी एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) में विशेष सावधानी (BSL2 +) की सुविधा के साथ किया जाना चाहिए लायक है।
Introduction
संयुक्त एंटी-रेट्रोवायरल थेरेपी की सफलता के बावजूद, एचआईवी संक्रमण अभी भी एक आजीवन बीमारी है। एचआईवी के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एचआईवी प्रतिकृति को नियंत्रित करने में अत्यधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्टेम सेल हेरफेर में हाल के अग्रिमों जीन थेरेपी के तेजी से विकास के लिए अनुमति दी गई है एचआईवी उपचार 1-3 के लिए दृष्टिकोण। नतीजतन, यह एक उचित पशु मॉडल है कि एचआईवी के खिलाफ सेल आधारित चिकित्सा की प्रभावकारिता के vivo अध्ययन में अनुमति देता है के लिए महत्वपूर्ण है।
पशु मॉडल में एचआईवी के साथ कार्य तथ्य यह है कि वायरस केवल मानव कोशिकाओं को संक्रमित करता है से जटिल है। इस सीमा को नाकाम करने के लिए, वैज्ञानिकों रीसस मकाक 4,5 में सिमीयन इम्यूनो वायरस (SIV) जैसे रोग मॉडल का उपयोग करने के लिए सहारा है। दुर्भाग्य से, वहाँ प्रजातियों भर में निहित मतभेद और SIV और एचआईवी के बीच मतभेद के कारण इस मॉडल में प्रमुख सीमाएं हैं। इसके अतिरिक्त, केवल अति विशिष्ट सुविधाओं ग रहे हैंगैर मानव प्राइमेट और प्रत्येक मकाक के साथ काम करने का समर्थन करने का apable एक बड़े निवेश की आवश्यकता है। इस प्रकार, वहाँ है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली है, जो एचआईवी संक्रमण / रोगजनन की संभावना है इस्तेमाल करता है, और कम आर्थिक रूप से निषेधात्मक है एक मॉडल के लिए एक दबाने की जरूरत है।
(या एनएसजी) रक्त / एक महत्वपूर्ण उपकरण जिगर / थाइमस (बीएलटी) humanized माउस मॉडल तेजी से साबित हो रहा है गैर-मोटे मधुमेह (इशारा) संयुक्त immunodeficient (एस.सी.आई.डी) -common गामा चेन पीटकर – (- / सी γ) -severe एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए। Hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और भ्रूण थाइमस दाखिल करके, चूहों को विकसित करने और एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को 1-3 पुनरावृत्ति करने में सक्षम हैं। स्टेम सेल आधारित जीन थेरेपी का एक प्रकार hematopoietic स्टेम सेल (एचएससी) reprogramming प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं में अंतर करने से एचआईवी निशाना बनाने के लिए 'पुनः निर्देशित' परिधीय टी कोशिकाओं शामिल है। हम पहले से पता चला है कि एक आणविक क्लोन विरोधी एचआईवी विशेष टी सेल के साथ पुन: इंजीनियरिंग एचएससीceptor (TCR) SL9 मिलान (अमीनो एसिड 77-85; SLYNTVATL) के खिलाफ एचआईवी -1 झूठ परिपक्व टी कोशिकाओं कि humanized एनएसजी-बीएलटी माउस मॉडल 6 में एचआईवी प्रतिकृति को दबाने के गठन में स्टेम कोशिकाओं अनुप्रेषित कर सकते हैं। एक आणविक क्लोन TCR का उपयोग करने की चेतावनी है कि यह एक विशिष्ट मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) उप प्रकार है कि इस थेरेपी के आवेदन को सीमित कर देगा करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है। Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (सीएआर), दूसरे हाथ पर, सार्वभौमिक सभी एचएलए उपप्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। प्रारंभिक अध्ययन एक कार intracellular ζ CD3 के डोमेन के संकेत के लिए जुड़े हुए मानव सीडी 4 के बाह्य और transmembrane डोमेन के साथ निर्माण के उपयोग प्रदर्शन किया गया (CD4ζCAR कहा जाता है)। CD4ζCAR CD8 टी कोशिकाओं पर व्यक्त एचआईवी लिफाफा को समझते हैं और एक साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया है कि एक टी सेल रिसेप्टर 7 द्वारा मध्यस्थता के समान है ट्रिगर कर सकते हैं। हमने हाल ही में दिखा दिया है कि मानव एचएससी CD4ζCAR, जो तब कई hematopoietic ली में अंतर कर सकते के साथ संशोधित किया जा सकताneages, कार्यात्मक टी कोशिकाओं humanized माउस मॉडल 8 में एचआईवी प्रतिकृति को दबाने में सक्षम भी शामिल है। कैंसर के लिए 9 कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर उपचारों में तेजी से उन्नति, और शक्तिशाली व्यापक उदासीन एंटीबॉडी एचआईवी के खिलाफ 10-12 है कि एकल श्रृंखला एंटीबॉडी कारों के निर्माण की अनुमति के चल रहे लक्षण वर्णन के साथ, यह समझ योग्य है कि कई नए उम्मीदवार निर्माणों, CD4ζCAR के अतिरिक्त है , उत्पन्न होता है और एचआईवी रोग और अन्य बीमारियों के स्टेम सेल आधारित जीन थेरेपी के लिए परीक्षण किया जाएगा। इसके अलावा, humanized एनएसजी-बीएलटी माउस इन विशिष्ट प्रतिजन सीएआर युक्त मॉडल भी बारीकी से vivo में मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात है, हमारे प्रोटोकॉल बीएलटी चूहों कि एचएससी पतला प्रोटीन मिश्रण में भ्रूण जिगर चड्डी 16 के स्थान पर प्रयोग किया जाता है में 13-15 की humanized के निर्माण के लिए पिछले वर्णित विधि से अलग है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन: 1) हमानी के निर्माणजेड बीएलटी चूहों CD4ζCAR के साथ इंजीनियर; और 2) आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के भेदभाव के लक्षण वर्णन; और 3) आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की कार्यक्षमता की विशेषता।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार और नैदानिक अध्ययन की दिशा में एचएससी आधारित इंजीनियर प्रतिरक्षा को गति प्राप्त कर रहा है, यह एक उचित पशु मॉडल बारीकी से भेदभाव और इन इंजीनियर कोशिकाओं के समारोह की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
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