Stamcells Baserat Engineered immunitet mot HIV-infektion i humaniserad musmodell
Summary
This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.
Abstract
Med den snabba utvecklingen av stamcellsbaserade genterapier mot HIV, finns det tunga kravet på en djurmodell för att studera den hematopoietiska differentiering och immunfunktion av de genetiskt modifierade cellerna. Den humaniserade Benmärgs / Lever / Thymus (BLT) musmodell möjliggör full upplösning av en människans immunsystem i periferin, vilket inkluderar T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter. Den mänskliga tymus implantatet möjliggör också tymus urval av T-celler i autolog tymusvävnad. Förutom studien av HIV-infektion, står modellen som ett kraftfullt verktyg för att studera differentiering, utveckling och funktion av celler som härrör från hematopoetiska stamceller (HSCs). Här redogör vi konstruktionen av humaniserad icke-feta diabetiska (NOD) -severe kombinerad immunbrist (SCID) -common gammakedjan knockout (c γ – / -) -Bone-märg / Lever / Thymus (NSG-BLT) möss med HSCs transducerade med CD4 chimär antigenreceptor (CD4CAR)lentivirus-vektor. Vi visar att CD4CAR HSCs framgångsrikt kan differentiera i flera linjer och har anti-HIV-aktivitet. Målet med studien är att demonstrera användningen av NSG-BLT musmodell som en modell för konstruerad immunitet mot HIV in vivo. Det är värt att notera att, eftersom lentivirus och mänsklig vävnad används bör experiment och operationer utföras i klass II biosäkerhet skåp i en biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) med särskilda försiktighetsåtgärder (BSL2 +) anläggning.
Introduction
Trots framgångarna med kombinerade antiretroviral behandling, är HIV-infektion fortfarande en livslång sjukdom. Det cellulära immunsvaret mot HIV spelar mycket viktig roll i kontrollen HIV-replikation. Nya framsteg inom stamcells manipulation har gjort för den snabba utvecklingen av genterapi metoder för HIV-behandling 1-3. Som ett resultat, är det viktigt att ha en ordentlig djurmodell som möjliggör in vivo-studie av effektiviteten av cellbaserade terapier mot HIV.
Att arbeta med HIV i djurmodeller kompliceras av det faktum att viruset infekterar endast humana celler. För att kringgå denna begränsning, har forskare tillgripit att använda sjukdomsmodeller som Simian immunbristvirus (SIV) i Rhesus-makaker 4,5. Tyvärr finns stora begränsningar i denna modell på grund av de inneboende skillnaderna mellan arter och skillnaderna mellan SIV och HIV. Dessutom, bara mycket specialiserade anläggningar är capable att stödja arbetet med icke-mänskliga primater och varje makak kräver en stor investering. Det finns således ett stort behov av en modell som utnyttjar det mänskliga immunsystemet, som är mottagliga för HIV-infektion / patogenes, och är mindre ekonomiskt oöverkomliga.
Den icke-feta diabetiska (NOD) -severe kombinerad immunbrist (SCID) -common gammakedjan knockout (c γ – / -) (eller NSG) Blod / Lever / Thymus (BLT) humaniserad musmodell alltmer visat sig vara ett viktigt verktyg att studera HIV-infektion. Genom att implantera hematopoetiska stamceller (HSC: er) och fetal tymus, mössen kan utveckla och sammanfatta en människans immunsystem 1-3. En typ av stamcellsbaserad genterapi innebär "styra" perifera T-celler att rikta hiv genom omprogrammering hematopoetiska stamceller (HSCs) att differentiera till antigenspecifika T-celler. Vi har visat tidigare att ingenjörs HSCs med en molekyl klonad anti-HIV-specifika T-cell reCeptor (TCR) mot SL9 epitopen (aminosyra 77-85; SLYNTVATL) av HIV-1 Gag kan omdirigera stamceller till att bilda mogna T-celler som undertrycker HIV-replikation i den humaniserade NSG-BLT musmodell 6. Förbehållet att använda en molekylär klonad TCR är att det är begränsat till en viss HLA-antigen (HLA) undertyp som kommer att begränsa tillämpningen av denna terapi. Chimära antigenreceptorer (CAR), å andra sidan, kan allmänt tillämpas på alla HLA subtyper. Inledande studier genomfördes med användning av en bil konstruerad med de extracellulära och transmembrandomänerna av humant CD4 smält till den intracellulära ζ signalering domän av CD3 (kallas CD4ζCAR). CD4ζCAR uttryckt på CD8 T-celler kan känna igen HIV-hölje och utlösa ett cytotoxiskt T-cellsvar som liknar den som förmedlas av en T-cellsreceptor 7. Vi har nyligen visat att humana HSC: er kan modifieras med CD4ζCAR, som sedan kan differentiera i flera hematopoetisk lineages, inklusive fungerande T-celler med förmåga att undertrycka HIV-replikation i den humaniserade musmodellen 8. Med den snabba utvecklingen i chimära antigenreceptor terapier för cancer 9, och den pågående karakterisering av potenta breda neutraliserande antikroppar 10-12 mot HIV som medger konstruktion av enkelkedjiga CARs antikropps är det förnimbara att många nya kandidat konstruktioner, förutom CD4ζCAR , kommer att genereras och testas för stamcellsbaserad genterapi av HIV-sjukdomar och andra sjukdomar. Dessutom kan humaniserade NSG-BLT musmodell som innehåller dessa antigen specifika fordon också ett användbart verktyg för att noggrant undersöka humana T-cellsvar in vivo. Viktigare, skiljer våra protokoll från tidigare beskrivna metoder för konstruktion av humaniserad av BLT-möss 13-15 i att HSCs i gelatinösa proteinblandning används i stället för fetala lever trunkar 16. Detta protokoll beskriver: 1) konstruktion av huzed BLT möss manipulerade med CD4ζCAR; och 2) karaktärisering av differentieringen av de genetiskt modifierade cellerna; och 3) karakterisering av funktionaliteten av de genetiskt modifierade cellerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med CAR och HSC-baserade konstruerad immunitet fart mot kliniska studier, är det viktigt att ha en ordentlig djurmodell för att närmare undersöka differentiering och funktion av dessa manipulerade celler. I detta protokoll beskrivs vi de metoder för att konstruera och testa humaniserade möss med genetiskt modifierade stamceller konstruerade mot HIV. Det är viktigt att ha en effektiv transduktion av stamceller före transplantation. Emellertid, tack vare förmågan hos T-cellen att proliferera vid igenkänning av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)
Materials
| CD34 microbead kit | miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | for freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm – 1000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice–an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
