عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة
Summary
نحن هنا وصف الورقية طريقة استخراج الحمض النووي بسيطة وسريعة من فيروس نقص المناعة البشرية proviral DNA من الدم الكامل الكشف عنها بواسطة PCR الكمي. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لاستخدامها في الكشف عن علامات وراثية أخرى أو استخدام أساليب التضخيم بديلة.
Abstract
الاتحاد الدولي للسباحة، والعزلة الترشيح من الأحماض النووية، هو طريقة استخراج الرواية التي تستخدم الترشيح الرأسي عن طريق الغشاء الفاصل وسادة ماصة لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم كله في أقل من 2 دقيقة. يتم التعامل مع عينة الدم مع المنظفات، لفترة وجيزة مختلطة وتطبيقها بواسطة الماصة لغشاء الفصل. المحللة الفتائل في لوحة النشاف بسبب العمل الشعري، واستولت على الحمض النووي الجيني على سطح الغشاء الفاصل. يتم الاحتفاظ الحمض النووي المستخرج على الغشاء خلال خطوة غسل بسيطة حيث مثبطات PCR هي الشريرة في لوحة النشاف ماصة. ثم يتم إضافة غشاء التي تحتوي على الحمض النووي فخ للتفاعل PCR دون مزيد من التنقية. لا تتطلب هذه الطريقة البسيطة ومعدات المختبرات ويمكن تنفيذها بسهولة مع وازم المختبرات وغير مكلفة. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف حساسة للغاية والكميات من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر الدم كله كنموذج لفي وقت مبكرالتشخيص فانت من فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن بسهولة أن تتكيف مع أهداف وراثية أخرى.
Introduction
وناقش العديد من التقارير تطوير أساليب الاستخراج paper- أو التي تعتمد على الأغشية للاستخدام في نقطة من الرعاية (POC) الأجهزة 1-5 بهدف جعل حساسية رائعة وخصوصية التشخيص الجزيئي للجميع. صاغ منظمة الصحة العالمية (WHO) الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي مبادرة التشخيص على المدى ASSURED (بأسعار معقولة، الحساسة، محددة، وسريعة وقوية، خالية من المعدات وتسليمها لأولئك الذين في حاجة إليها المستخدم ودية) لوصف خصائص مثالية لPOC اختبار 6. من هذه المبادئ التوجيهية، فإن السمة خالية من المعدات تحديا من نوع خاص لتحقيق التشخيص الجزيئي. ومع ذلك، فإن كل الابتكار في مجال تحقيق هدف الوصول إلى من هم في أشد الحاجة، وليس هناك أمل في تحسن على المدى القريب في أداء الاختبار عن طريق التكيف مع التكنولوجيا الحالية 7.
نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الدم الكاملالتي لا تتطلب الكيمياء المعقدة أو الأجهزة المخبرية. الاتحاد الدولي للسباحة (الترشيح عزل الأحماض النووية) طريقة تحضير العينة وضعت أصلا لاستخراج الحمض النووي الكريات البيض من الدم الكامل من أجل كشف طليعة الفيروس HIV-1 كجزء من عينة إلى الإجابة نقطة من الرعاية (POC) الكمي PCR (QPCR) الرضع في وقت مبكر للتشخيص (عيد) منصة للاستخدام في بيئات محدودة الموارد 8-11. استخراج الاتحاد الدولي للسباحة يختلف عن أساليب تنقية التقليدية التي تستخدم الأغشية السيليكا أو جزيئات ممغطس المغلفة السيليكا لربط عكسية الحمض النووي في حضور وكلاء chaotropic 12. بدلا من ذلك، يستخدم الاتحاد الدولي للسباحة الترشيح الرأسي عبر غشاء الفصل لاستخراج الحمض النووي الخلوي من الدم الكامل مباشرة. غشاء التي تحتوي على الحمض النووي شرك يمكن وضعها مباشرة في أنبوب PCR وإما استخدامها على الفور في تفاعل PCR أو الهواء المجفف لاحق التضخيم 9. تستخدم أي chaotropic وكلاء، والفينول، أو الكحول في استخراج عينة، eliminaتينغ خطوات الغسيل واسعة اللازمة لإزالة مثبطات QPCR قوية مستمدة من عملية الاستخراج 13،14.
غشاء الاتحاد الدولي للسباحة يمكن التقاط إما خلايا 9 أو الحمض النووي الجيني حررها خلية تحلل 11 قبل يتم إضافة العينة إلى الغشاء. لالتقاط الخلايا، يتم إضافة الدم الكامل مباشرة إلى الغشاء. وهي lysed الخلايا بعد ذلك في غشاء من خلال إضافة 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم. ميزة لهذا الأسلوب هو أنه ينطوي فقط 3 خطوات: 1) عينة بالإضافة. 2) خلية تحلل / غسيل و 3) وضع القرص مرشح في أنبوب QPCR. العيب إلى هذا الأسلوب هو أن غشاء يمكن أن تعقد سوى عدد محدد من الخلايا يتناسب طرديا مع قطر القرص الغشاء. للوصول إلى الحد من الكشف المطلوبة للعيد، و 100 ميكرولتر من الدم الكامل هو مطلوب لإدخال عينة الذي ينطوي على مرشح كبير جدا بحيث يمكن وضعها في أنبوب QPCR. الناشر خلايا الدم مع المنظفات قبل إضافة العينة إلى جمعويضيف غشاء خطوة المعالجة، ولكن يسمح باستخدام مرشح أصغر لنفس حجم العينة. كنا قادرين على إثبات استنساخ عالية، والكشف عن نسخة واحدة، وتقدير حجم اقل من 10 نسخ من HIV-1 proviral الحمض النووي من 100 ميكرولتر من الدم باستخدام هذا التكوين اختبار 11.
في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الاتحاد الدولي للسباحة كما وضعت أصلا للاستخدامات المختبرية. شطيرة غشاء / فلتر المعروفة باسم وحدة إعداد نموذج الاتحاد الدولي للسباحة يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها لاستخدامها لاحقا. عندما تكون العينات ليكون استخراجه هذه العملية تستغرق مدة 2 دقيقة، ويمكن أداؤها في متفاوتة دفعات الحجم. وQPCR يمكن تشغيلها مباشرة أو المرشحات التي تحتوي على الحمض النووي جزءا لا يتجزأ من يمكن تخزين حتى أنها مريحة لأداء QPCR. هذه الطريقة مناسبة جدا لتحليل الروتيني للعينات في كل من إعدادات الموارد المنخفضة والعالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تجلى عيد مرتبطة الحصول على العلاج السريع للحد من وفيات الأطفال بسبب عدوى فيروس نقص المناعة البشرية (16). بسبب استمرار الأجسام المضادة الأمهات في الدم الرضيع وسريعة اختبارات الأجسام المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية محدودة فائدة في تحديد وضع الرضع الذين تع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. “Paper Machine” for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. . Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. . Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- . . World Health Organization. , (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots–preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
