Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide
Summary
Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.
Abstract
FINA, l'isolement de filtration d'acides nucléiques, est une nouvelle méthode d'extraction qui utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation et un tampon absorbant pour extraire l'ADN cellulaire du sang entier en moins de 2 minutes. L'échantillon de sang est traité avec un détergent, brièvement mélangés et appliqués à la pipette sur la membrane de séparation. Le lysat en évacuant le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface de la membrane de séparation. L'ADN extrait est retenu sur la membrane lors d'une étape de lavage simple, dans laquelle les inhibiteurs de PCR sont méchants dans le tampon buvard absorbant. La membrane contenant l'ADN piégé est ensuite ajouté à la réaction de PCR sans autre purification. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement de laboratoire et peut être facilement mis en œuvre avec des fournitures de laboratoire peu coûteux. Nous décrivons ici un protocole de détection très sensible et la quantification de l'ADN du VIH-1 proviral de sang total de 100 ul en tant que modèle pour le début dele diagnostic fant du VIH qui pourraient facilement être adapté à d'autres cibles génétiques.
Introduction
Plusieurs rapports ont discuté de l'élaboration de méthodes d'extraction de papier ou à base de membranes pour une utilisation au point-of-care (POC) dispositifs 1-5 avec le but de rendre la sensibilité exquise et la spécificité du diagnostic moléculaire disponible pour tous. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) sur les maladies sexuellement transmissibles Initiative Diagnostics a inventé le terme ASSUREE (, sensible, spécifique, conviviale, rapide et robuste, sans équipement et livré à ceux qui en ont besoin abordables) pour décrire les caractéristiques idéales d'un POC essai 6. Parmi ces lignes directrices, la caractéristique sans équipement est particulièrement difficile à réaliser pour le diagnostic moléculaire. Cependant, toute innovation dans le domaine va avancer l'objectif d'atteindre ceux qui en ont le plus besoin, et il y a un espoir d'amélioration à court terme des performances de test en adaptant la technologie 7 existante.
Nous décrivons ici un protocole simple pour extraire l'ADN du sang totalqui ne nécessite pas la chimie complexe ou l'instrumentation de laboratoire. La FINA (Isolement de filtration d'acides nucléiques) méthode de préparation des échantillons a été initialement développé pour extraire l'ADN des leucocytes du sang entier afin de détecter le VIH-1 provirus dans le cadre d'un point-of-care (POC) échantillon à réponse PCR quantitative (qPCR) infantile diagnostic précoce plate – forme (EID) pour une utilisation dans des contextes de ressources limitées 8-11. L' extraction FINA diffère des procédés de purification classiques qui utilisent des membranes de silice ou des particules paramagnétiques enrobées de silice de se lier de façon réversible l' ADN en présence d'agents chaotropes 12. Au lieu de cela, la FINA utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation pour en extraire l'ADN cellulaire du sang entier directement. La membrane contenant l'ADN piégé peut être placé directement dans un tube PCR et soit immédiatement utilisée dans une réaction PCR ou séché à l' air pour une amplification ultérieure 9. Aucun des agents chaotropiques, le phénol, ou les alcools sont utilisés dans l'extraction de l'échantillon, eliminating les vastes Les étapes de lavage nécessaires pour éliminer les inhibiteurs de qPCR puissants issus du processus d'extraction 13,14.
La membrane peut capturer la FINA soit des cellules 9 ou l' ADN génomique libéré par la lyse des cellules 11 avant que l'échantillon est ajouté à la membrane. Pour la capture des cellules, du sang entier est ajouté directement à la membrane. Les cellules sont ensuite lysées dans la membrane par addition de NaOH 10 mM. L'avantage de cette méthode est qu'elle ne comporte que trois étapes: 1) addition de l'échantillon; 2) la lyse cellulaire / lavage et 3) le placement filtre à disque dans qPCR tube. L'inconvénient de cette méthode est que la membrane peut contenir uniquement un nombre défini de cellules directement proportionnelle au diamètre du disque de membrane. Pour atteindre la limite de détection requis pour EID, 100 ul de sang entier est nécessaire pour l'entrée échantillon qui comporte un filtre qui est trop grand pour être placé dans un tube qPCR. La lyse des cellules du sang avec un détergent avant d'ajouter l'échantillon à la collectionMembrane ajoute une étape de traitement, mais permet l'utilisation d'un filtre plus faible pour la même taille de l'échantillon. Nous avons été en mesure de démontrer une reproductibilité élevée, la détection de copie unique, et la quantification de aussi peu que 10 copies de VIH-1 ADN proviral de 100 pi de sang à l' aide de cette configuration de test 11.
Dans ce rapport, nous décrivons le protocole FINA initialement développé pour une utilisation en laboratoire. Le sandwich membrane / filtre connu sous le nom du module de préparation d'échantillon FINA peut être préparé en grandes séries et stocké pour une utilisation ultérieure. Quand les échantillons doivent être extraits, ce processus prend 2 minutes et peut être réalisée en faisant varier la taille des lots. Le qPCR peut être exécuté immédiatement ou les filtres contenant l'ADN intégré peut être stocké jusqu'à ce qu'il soit commode d'exécuter qPCR. Cette méthode est très pratique pour l'analyse de routine des échantillons dans les deux milieux basses et hautes ressources.
Protocol
Representative Results
Discussion
EID liée à l' accès à un traitement rapide a été démontrée pour réduire la mortalité infantile due à l' infection par le VIH 16. En raison de la persistance des anticorps maternels dans le sang d'un enfant, les tests rapides d'anticorps anti-VIH ont une utilité limitée pour déterminer le statut des nourrissons exposés au VIH. L'OMS recommande que tous les nourrissons nés de mères VIH-1 positifs devraient être testés à 4-6 semaines d'âge, à l' aide d' un te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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