Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido
Summary
Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.
Abstract
FINA, filtração isolamento de ácidos nucleicos, é um método de extracção que utiliza filtração romance vertical, através de uma membrana de separação e uma almofada absorvente para extrair ADN celular do sangue total em menos de 2 min. A amostra de sangue é tratada com o detergente, misturada brevemente e aplicada por uma pipeta para a membrana de separação. O lisado pavios para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície da membrana de separação. O DNA extraído é retida na membrana durante um simples passo de lavagem em que inibidores da PCR são maus para o mata-borrão absorvente. A membrana contendo o ADN retido é então adicionado à reacção de PCR sem purificação adicional. Este método simples não requer equipamento laboratorial e pode ser facilmente implementado com material de laboratório de baixo custo. Descrevemos aqui um protocolo para a detecção altamente sensível e quantificação do VIH-1 ADN proviral de 100 ul de sangue inteiro como um modelo para o iníciofant diagnóstico do HIV que pode ser facilmente adaptada a outros alvos genéticos.
Introduction
Vários relatórios têm discutido o desenvolvimento de métodos de extracção aplicada sobre papel ou à base de membrana para uso em point-of-care (POC) dispositivos 1-5 com o objectivo de tornar a requintada sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular disponíveis para todos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) Doenças Sexualmente Transmissíveis Diagnostics Iniciativa cunhou o termo assegurada (, sensível, específico, rápido e robusto, livre de Equipamentos e entregue a quem precisa fácil utilização acessível) para descrever as características ideais de um POC teste 6. Destas orientações, a característica livre de equipamento é particularmente difícil de conseguir para diagnóstico molecular. No entanto, todas as inovações no campo vai avançar o objetivo de alcançar os mais necessitados, e não há esperança para melhorias de curto prazo no desempenho do teste, adaptando a tecnologia existente 7.
Descrevemos aqui um protocolo simples para a extracção de ADN a partir de sangue inteiroque não requer a química complexa ou instrumentação de laboratório. A FINA (isolamento filtração de ácidos nucleicos) método de preparação da amostra foi originalmente desenvolvido para extrair o ADN de leucócitos a partir de sangue total, a fim de detectar o pró-vírus de HIV-1 como parte de um ponto de atendimento (POC) de amostra-para-resposta de PCR quantitativa plataforma (qPCR) no início infantil de diagnóstico (EID) para uso em ambientes de recursos limitados 8-11. Extracção FINA difere dos métodos de purificação convencionais que utilizam membranas de sílica ou partículas paramagnéticas revestidas de sílica para se ligar reversivelmente o DNA na presença de 12 agentes caotrópicos. Em vez disso, utiliza FINA verticais filtração através de uma membrana de separação para extrair o ADN celular directamente a partir de sangue total. A membrana contendo o ADN retido pode ser colocada directamente num tubo de PCR e, ou imediatamente utilizados numa reacção de PCR ou seco ao ar para amplificação posterior 9. Sem caotrópicos agentes, fenol, ou álcoois são utilizados na extracção da amostra, EliminaTing os extensos passos de lavagem necessários para remover inibidores potentes qPCR derivadas do processo de extracção 13,14.
A membrana FINA pode capturar tanto células 9 ou ADN genómico libertado por lise da célula 11 antes que a amostra é adicionada à membrana. Para a captura de células, sangue total é adicionado directamente à membrana. As células são subsequentemente lisadas na membrana através da adição de NaOH a 10 mM. A vantagem deste método é que ele envolve apenas três passos: 1) a adição da amostra; 2) lise celular / lavagem e 3) a colocação disco de filtro no tubo de qPCR. A desvantagem deste método é que a membrana pode conter apenas um número definido de células directamente proporcional ao diâmetro do disco de membrana. Para atingir o limite de detecção requerido para Eid, 100 uL de sangue total é necessária para a entrada de amostra, o que implica um filtro que é demasiado grande para ser colocada num tubo de qPCR. Lisar as células do sangue com o detergente antes da adição da amostra para a recolhamembrana adiciona uma etapa de processamento, mas permite o uso de um filtro mais pequeno para o mesmo tamanho da amostra. Fomos capazes de demonstrar a alta reprodutibilidade, detecção de cópia única, e quantificação de menos de 10 cópias do HIV-1 DNA proviral de 100 l de sangue usando esta configuração de teste 11.
Neste relatório, nós descrevemos o protocolo FINA como originalmente desenvolvido para uso em laboratório. A sanduíche de membrana / filtro conhecido como o módulo de preparação de amostra FINA pode ser preparado em grandes lotes e armazenadas para uso posterior. Quando as amostras são para ser extraído este processo leva 2 min e pode ser realizada em vários lotes de tamanho. A qPCR pode ser executado imediatamente ou os filtros que contenham o ADN incorporado pode ser armazenado até que seja conveniente para realizar qPCR. Este método é muito conveniente para a análise de rotina de amostras em ambas as configurações de baixa e alta de recursos.
Protocol
Representative Results
Discussion
EID ligada ao acesso rápido tratamento foi demonstrada para reduzir a mortalidade infantil devido à infecção pelo HIV 16. Devido à persistência de anticorpos maternos no sangue de uma criança, os testes rápidos anti-HIV têm utilidade limitada para determinar o status de crianças expostas ao HIV. A OMS recomenda que todas as crianças nascidas de mães HIV-1 positivas devem ser testados em 4-6 semanas de idade, usando um teste virológico 17. Nós relataram o desenvolvimento de um ensaio p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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