Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции
Summary
Мы опишем здесь простой и быстрый на бумажной основе метода экстракции ДНК ДНК ВИЧ провирусной из цельной крови обнаружен с помощью количественной ПЦР. Этот протокол может быть расширен для использования в обнаружении других генетических маркеров или с использованием альтернативных методов амплификации.
Abstract
FINA, изоляция фильтрация нуклеиновых кислот, представляет собой новый способ экстракции, который использует вертикальную фильтрацию для извлечения ДНК клеток из цельной крови менее чем за 2 мин через разделительную мембрану и абсорбирующей прокладки. Образец крови обрабатывают с помощью моющих средств, смешанных кратко и наносится пипеткой на разделительной мембраны. Лизат фитили в промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности разделительной мембраны. Извлеченный ДНК удерживается на мембране во время простой стадии промывки, где ингибиторы ПЦР нечестивы в абсорбирующий блокнот с промокательной бумагой. Мембрана, содержащая захваченный ДНК затем добавляют в реакционную смесь для ПЦР без дополнительной очистки. Этот простой метод не требует лабораторного оборудования и могут быть легко реализованы с помощью недорогих лабораторных принадлежностей. Здесь мы опишем протокол для высокочувствительного обнаружения и количественного определения ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл цельной крови в качестве модели для раннейFant диагностика ВИЧ, которые могут быть легко адаптированы к другим генетическим целям.
Introduction
В ряде докладов были обсуждены вопросы развития бумажно или мембран на основе методов извлечения для использования в пункте оказания медицинской помощи (ПСУ) устройства 1-5 с целью сделать изящную чувствительность и специфичность молекулярной диагностики доступной для всех. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) венерических болезней Инициатива Диагностика ввел термин уверил (Бюджетное, Чувствительный, конкретные, Удобный, быстрый и надежная, оборудование свободные и доставляется к тем, кто в ней нуждается), чтобы описать идеальные характеристики ВОК тест 6. Из этих руководящих принципов, оборудование свободной характеристикой является особенно сложной задачей для достижения молекулярной диагностики. Тем не менее, каждое нововведение в области будет продвигать цель достичь тех , кто больше всего нуждается, и есть надежда на ближайшую перспективу улучшения в проведении испытания путем адаптации существующих технологий 7.
Здесь мы опишем простой протокол для экстракции ДНК из цельной кровичто не требует сложной химии или лабораторного оборудования. FINA (фильтрация выделение нуклеиновых кислот) способ подготовки проб был первоначально разработан для извлечения лейкоцитарной ДНК из цельной крови с целью выявления ВИЧ-1 провируса как часть образца до ответа точки оказания медицинской помощи (ПСУ) количественной ПЦР диагностики (ВИЗ) платформа детей раннего возраста (КПЦР) для использования в условиях ограниченных ресурсов 8-11. FINA добыча отличается от традиционных способов очистки , которые используют кремнеземные мембран или парамагнитные частицы диоксида кремния , покрытые обратимо связывать ДНК в присутствии хаотропных агентов 12. Вместо этого FINA использует вертикальную фильтрацию с помощью разделительной мембраны для извлечения клеточной ДНК из цельной крови непосредственно. Мембрана , содержащая захваченный ДНК может быть помещена непосредственно в пробирку для ПЦР , и либо непосредственно использовали в реакции ПЦР или сушат на воздухе в течение последующего усиления 9. Нет хаотропные агенты, фенол, или спирты не используются при экстракции образца, eliminaтин обширные стадии промывки , необходимые для удаления мощные ингибиторы КПЦР , полученные из процесса экстракции 13,14.
Мембрана FINA может выполнять захват либо клеток 9 или геномную ДНК , освобожденные от лизиса клеток 11 до того , как образец добавляется к мембране. Для захвата клетки, цельной крови добавляют непосредственно к мембране. Клетки затем лизируют в мембране путем добавления 10 мМ NaOH. Преимущество этого метода заключается в том, что она включает в себя только 3 шага: 1) образец дополнение; 2) лизис клеток / мытья и 3) размещение фильтра диска в КПЦР трубке. Недостаток этого метода состоит в том, что мембрана может содержать только определенное количество клеток прямо пропорционально диаметру мембранного диска. Для того, чтобы достичь предела обнаружения, требуемого для EID, 100 мкл цельной крови требуется для ввода образца, который влечет за собой фильтр, который слишком велик, чтобы быть помещенной в трубку КПЦР. Лизиса клеток крови с помощью моющего средства перед добавлением образца в коллекциюмембрана добавляет стадию обработки, но позволяет использовать меньший фильтр для того же самого размера образца. Мы смогли продемонстрировать высокую воспроизводимость, одного обнаружения копирования и количественно оценить всего лишь 10 копий ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл крови с помощью этой тестовой конфигурации 11.
В этом докладе мы опишем FINA протокол, первоначально разработанный для использования в лабораториях. Сэндвич мембрана / фильтр известен как FINA модуль подготовки пробы может быть получен в больших количествах и складированы для последующего использования. При проведении анализа проб должны быть извлечены этот процесс занимает 2 мин и может быть выполнена в различных партий размера. КПЦР может быть запущена немедленно или фильтры, содержащие внедренный ДНК могут быть сохранены до тех пор, пока удобно выполнять КПЦР. Этот метод очень удобен для рутинного анализа образцов в обоих параметрах низких и высоких ресурсов.
Protocol
Representative Results
Discussion
ВИЗ связан с быстрым доступом к лечению было продемонстрировано для снижения детской смертности из – за ВИЧ – инфекции 16. Из-за сохранения материнских антител в крови младенца, экспресс-тесты на ВИЧ антитела имеют ограниченную полезность в определении статуса ВИЧ младенцев. ВОЗ р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. “Paper Machine” for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. . Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. . Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- . . World Health Organization. , (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots–preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
