Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Dendritische cellen (DCs) zijn essentiële mediatoren van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Zij functioneren primaire immuunreacties induceren en de ontwikkeling van immunologische geheugen vergemakkelijken. Deze cellen zijn primair verantwoordelijk voor antigen capture, migratie en T-cel stimulatie en worden derhalve aangeduid als professionele antigeen presenterende cellen (APC's) 1 .Manipulation van DCs kan worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeksgebieden en de klinische setting voor de behandeling van verschillende ontstekingsziekten zoals HIV 6,7, 8 kanker, auto-immuunziekten 9 en allergische reacties 10. DC's worden ook gebruikt voor drugsmisbruik onderzoek om onbekende mechanismen en paden, zoals die in verband met afhankelijkheid van alcohol 11-14, drugsverslaving 13,15, en de combinatie van HIV-infectie en drugsmisbruik 16-19 op te lossen. Deze lopende studies en toekomstig onderzoek studies in het gebied van immunologie maken vitro generatie DCs van groot belang voor onderzoek. Er zijn echter een aantal problemen van de isolatie DCs uit menselijk bloed zij slechts 0,1 uitmaken – 1% van de totale mononucleaire cellen 20.
Tot op heden enkele gevestigde werkwijzen voor het genereren van DCs in vitro uit kunststof of glas hechting van monocyten 21,22, dichtheid gradiënt centrifugatie 23 specifieke merker gebaseerde scheiding zoals magnetische geactiveerde celsortering 22, fluorescent geactiveerde celsortering 24, positieve selectie van CD14 + monocyten met behulp van dextran beklede magnetische nanodeeltjes 25 en snelle isolatie van sterk gezuiverde monocyten met behulp van volledig geautomatiseerde negatieve celselectie 26. De beste methode van keuze blijft controversieel. Daarom DC generatietechnieken verbeteren, zijn verschillende methoden ontwikkeld waarbijde zuiverheid van deze cellen sterk vergroten door differentiatie van gezuiverde CD34 + progenitor cellen en monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) 27. Zoals voorafgaand genoemd, een veel gebruikte en populaire werkwijze voor het genereren van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) is het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27 verkennen. De hechting werkwijze is een snelle en eenvoudige methode die het gebruik van complexe apparatuur vereist. Echter enige nadelen van deze werkwijze omvatten lymfocyt besmetting geringe flexibiliteit en monocyt voorbijgaande manipulatie 28. Een alternatieve methode om de hechting methode is de magnetische isolatie van monocyten van totaal PBMC's, met name het gebruik van een menselijke monocyt verrijking kit, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie 26. Tijdens deze procedure worden ongewenste cellen gericht te verwijderen met tetrameerantilichaamcomplexen en dextran-beklede magnetische deeltjes. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste gemerkte cellen worden gescheiden met een magneet terwijl doelcellen vrij kan worden afgegoten in een nieuwe buis zonder de noodzaak voor kolommen. Tot op heden, door de beschikbaarheid van specifieke monoklonale antilichamen die unieke celpopulaties kunnen etiketteren, de magnetische scheidingstechniek is geworden, niet alleen een extra methode, maar een noodzaak voor het isoleren van zeldzame cellen op het gebied van immunologie. Bijvoorbeeld technieken zoals magnetische celsortering met een commercieel verkrijgbare paramagnetische MACS-nanodeeltjes hebben de ontwikkeling mogelijk van nieuwe benaderingen voor onderzoek en klinische toepassingen 22,29. Bovendien hebben recente studies vergelijken DC generatie van monocyten hechting en MACS technologie methoden een hogere DC zuiverheid en levensvatbaarheid aangetoond met behulp van MACS gescheiden monocyten 22,30.
De huidige studie presenteerteen vergelijking tussen twee werkwijzen voor het genereren van humane DCs van monocyten geïsoleerd uit PBMC: 1) isolatie van monocyt aanhechting en 2) monocyt isolatie door negatieve selectie met behulp van een commerciële kit menselijke monocyt verrijking. Deze studie geeft aanwijzingen dat de negatieve selectie magnetische scheidingswerkwijze om monocyten te isoleren genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Kortom, de huidige studie verschilt van de vorige studies bovengenoemde aangezien toont het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die kunnen prolifereren en differentiëren tot zijn CD11c +MDDCs (> 70%) na zeven dagen in de cultuur, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid. Daarnaast is de huidige benadering voorziet voor het eerst karakterisatie van verschillende CD11c / CD14 MDDCs populaties door beeldvorming flowcytometrie.
Kortom, omdat DCs een brandpunt rol ten aanzien van onderzoek op het gebied van de immunologie spelen, verschillende parameters moet rekening worden gehouden bij het overwegen van hoe ze worden afgeleid en welke methoden worden gebruikt voor het isoleren en kweken ze in vitro. Daarom is deze studie heeft tot doel inzicht te verschaffen over twee verschillende methoden van monocyten isolatie en hoe deze methoden differentieel invloed monocyten levensvatbaarheid en de opbrengst uiteindelijk van invloed zijn dendritische levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie en fenotype. Deze bevindingen sterk zal bijdragen aan het gebied van immunologie en zal een gedetailleerd protocol van DC isolatie, zuivering en karakterisatie verschaffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gebaseerd op de bekende problemen isoleren en het genereren MDDCs uit humaan bloed, deze studie gericht op een uitgebreide vergelijking van twee gevestigde werkwijzen voor het genereren van MDDCs verschaffen. De eerste methode vergeleken is een gevestigde traditionele werkwijze voor het MDDCs door gebruik van het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) 21,22,27. De hechting werkwijze is snel en kostenbesparend, en niet het gebruik van ingewikkelde apparatuur. Echter, een aantal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
