אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
תאים דנדריטים (DCS) הם מתווכים חיוניים של מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הן מתפקדות לגרום תגובה חיסונית ראשונית להקל על הפיתוח של זיכרון אימונולוגי. תאים אלה אחראים בעיקר עבור לכידת אנטיגן, הגירת גירוי תא T ולכן מכונים תאי מציגי אנטיגן מקצועיים כמו (נגמ"שים) 1 .Manipulation של DCs יכול להיות מנוצל על פני מגוון רחב של תחומי מחקר במסגרת הקלינית לטיפול שונה מחלות דלקתיות כגון HIV 6,7, סרטן 8, מחלות אוטואימוניות 9, ותגובות אלרגיות 10. DCs גם בשימוש למחקר התמכרות לסמים ואלכוהול על מנת לפתור מנגנונים לא ידועים מסלולים כגון אלה הקשורים בתלות באלכוהול 11-14, תלות בסמים 13,15, והשילוב של הידבקות ב- HIV ו חומר התעללות 16-19. מחקרים מתמשכים אלה ומחקרים בעתיד אניn בתחום האימונולוגיה לעשות בדור חוץ גופית של DCs חשוב מאוד למחקר. עם זאת, ישנם מספר קשיים הקשורים לבודד DCs מדם האדם כפי שהם רק מהווים 0.1 – 1% של תאים mononuclear הדם הכולל 20.
עד כה, חלק מהשיטות והמבוססות עבור הדור של DCs במבחנה מורכב דבקות פלסטיק או זכוכית של מונוציטים 21,22, צנטריפוגה שיפוע צפיפות 23, פרדה על בסיס סמן ספציפי כגון תא מגנטי מיון מופעל 22, תא מופעל פלורסנט מיון 24, סלקציה חיובית של מונוציטים CD14 + באמצעות חלקיקים מגנטיים צופה dextran 25, ובידוד מהיר של מונוציטים נקיים במיוחד באמצעות בחירת תא שלילית אוטומטית לחלוטין 26. עם זאת, השיטה הטובה ביותר של בחירה שנויה במחלוקת. לכן, כדי לשפר את טכניקות דור DC, מספר שיטות פותחו בהטוהר של תאים אלה יכולים להיות גדל מאוד על ידי בידול מתאי CD34 + אבי מטוהרים מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs) 27. כאמור לפני, שיטה המשמשת והפופולרי נרחב ליצירת תאים דנדריטים נגזר מונוציטים (MDDCs) היא לחקור את היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא שיטה מהירה וישירה שאינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, ומניפולציה חולפת מונוציטים 28. שיטה חלופית לשיטת הדבקות היא הבידוד המגנטי של מונוציטים מ PBMCs הכולל, במיוחד עם השימוש של ערכת העשרה מונוציטים אדם, אשר נועדה לבודד מונוציטים מ PBMCs ידי סלקציה שלילית 26. במהלך הליך זה, תאים לא רצויים ממוקדים להסרה עם tetramericמתחמי נוגדן וחלקיקים מגנטיים מצופה dextran. יתרונה של שיטת הבידוד הזה הוא כי התאים שכותרתו הרצויים מופרדים באמצעות מגנט בעוד תאי יעד יכולים להיות ניגרו בחופשיות לתוך צינור חדש ללא צורך עמודות. עד כה, עם הזמינות של נוגדנים ספציפיים monoclonal שיכול לתייג אוכלוסיות תאים ייחודיות, טכניקת הפרדה המגנטית הפכה לא פשוט שיטה נוספת, אלא הכרח עבור הבידוד של תאים נדירים בתחום האימונולוגיה. למשל, טכניקות כגון תא מגנטי מיון עם-חלקיקים MACS פאראמגנטיים זמינים מסחרית הקלו בפיתוח גישות חדשות למחקר ויישומים קליניים 22,29. יתר על כן, מחקרים מהזמן האחרון המשווה בין הדור DC משיטות הטכנולוגיה דבקות מונוציטים ו MACS הוכיחו טוהר DC גבוה ואת הכדאיות באמצעות MACS מופרדים מונוציטים 22,30.
מתנות המחקר הנוכחיותהשוואה בין שתי שיטות לייצור DCs האנושי מונוציטים מבודדים PBMCs: 1) בידוד מונוציטים ידי היצמדות 2) בידוד מונוציטים ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכת העשרה מונוציטים אדם מסחרית. מחקר זה מספק ראיות כדי להראות כי נוהל הפרדה המגנט סלקציה השלילית לבודד מונוציטים מייצר את התשואה הגבוהה ביותר של מונוציטים ללא הבדלים משמעותיים כדאי מונוציטים בהשוואת מונוציטים המבודדים בשיטת דבקות. בתורו, לאחר שבעה ימים, מונוציטים מבודדים על-ידי פרדה מגנטית מובחנים לתוך MDDCs עם יכולת שגשוג ואת סכום גבוה יותר באופן משמעותי גבוהים יותר של תאי מבטאים חיוביים כפול (CD11c + / CD14 +) פנוטיפ מבלי להשפיע כדאיות MDDC. בסה"כ, המחקר הנוכחי שונה מחקרים קודמים אשר בסימוכין שכן הוא מדגים את היכולת של שתי הטכניקות בו זמנית לייצר מונוציטים המסוגלים מתרבים ומבדל לתוך CD11c +MDDCs (> 70%) לאחר שבעה ימים בתרבות מבלי להתפשר הכדאיות שלהם. בנוסף, הגישה הנוכחית מספקת לאפיון לראשונה של אוכלוסיות שונות CD11c / CD14 MDDCs ידי זרימת הדמיה cytometry.
לסיכום, מאז DCs לשחק מוקדי תפקיד לגבי מחקר בתחום האימונולוגיה, פרמטרים שונים חייבים להילקח בחשבון כאשר בוחנים כיצד הם מתקבלים ומה שיטות משמשים לבודד ותרבות אותם במבחנה. לכן, מחקר זה נועד לספק תובנה על שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים וכיצד שיטות אלה באופן דיפרנציאלי להשפיע כדאיות מונוציטים ותשואה בסופו של דבר להשפיע על הכדאיות של תאים דנדריטים, התפשטות, פנוטיפ. ממצאים אלו יתרמו רבים בתחום האימונולוגיה ויספקו פרוטוקול מפורט של בידוד DC, טיהור, ואפיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתבסס על הקשיים הידועים של בידוד ויצירת MDDCs מדם אדם, המחקר הנוכחי נועד לספק השוואה מקיפה של שתי שיטות ומבוססות עבור הדור של MDDCs. השיטה הראשונה לעומת שיטה מסורתית ומבוססת להפקה MDDCs תוך ניצול היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
