Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
As células dendríticas (CDs) são mediadores essenciais dos sistemas imunitários inato e adaptativo. Eles funcionam para induzir respostas imunitárias primárias e facilitar o desenvolvimento de memória imunológica. Estas células são os principais responsáveis para a captura de antígeno, migração e estimulação das células T e, portanto, são chamados de células apresentadoras de antígenos, como profissionais (APCs) 1 .Manipulation de DCs poderiam ser utilizados em uma ampla variedade de campos de pesquisa e na prática clínica para o tratamento diferente doenças inflamatórias, tais como o VIH 6,7, 8 cancro, doenças auto-imunes, 9 e 10 respostas alérgicas. DCs também estão sendo usados para a investigação de abuso de substâncias, a fim de resolver os mecanismos desconhecidos e vias, tais como aqueles associados à dependência de álcool 11-14, dependência de drogas 13,15, ea combinação de infecção e abuso de substâncias HIV 16-19. Estes estudos em curso e futuros estudos in campo da imunologia fazer na geração in vitro de DCs extremamente importante para a investigação. No entanto, existem várias dificuldades associadas com o isolamento de DC a partir do sangue humano como elas constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue 20.
Até à data, alguns dos métodos bem estabelecidos para a geração de DC in vitro consiste em plástico ou vidro aderência de monócitos 21,22, centrifugação em gradiente de densidade de 23, a separação com base marcador específico, tais como triagem de células activadas magnética 22, triagem de células activadas fluorescentes 24, a selecção positiva de monócitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas revestidas com dextrano 25, e isolamento rápido de monócitos altamente purificados através de selecção celular negativa totalmente automatizado 26. No entanto, o melhor método de escolha permanece controverso. Portanto, para melhorar as técnicas de geração de DC, vários métodos têm sido desenvolvidos nos quaiso grau de pureza destas células pode ser aumentada pela diferenciação de células progenitoras CD34 + purificadas e os monócitos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) 27. Como mencionado antes, um método amplamente utilizado e popular para a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) é explorar a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é um método rápido e simples que não requerem o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, e monócitos manipulação transitória 28. Um método alternativo para o método de aderência é o isolamento magnético de monócitos a partir de PBMC totais, particularmente com o uso de um kit de enriquecimento de monócitos humanos, que se destina a isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa 26. Durante este procedimento, as células não desejadas são dirigidos para a remoção com tetraméricacomplexos de anticorpo e as partículas magnéticas revestidas com dextrano. A vantagem deste método de isolamento é que as células marcadas não desejados são separados usando um íman enquanto as células alvo podem ser vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas. Até à data, com a disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos que pode marcar populações de células únicas, a técnica de separação magnética tornou-se não só de um método adicional, mas também uma necessidade para o isolamento de células raras no campo da imunologia. Por exemplo, técnicas como a célula magnética triagem com paramagnéticas MACS-nanopartículas disponíveis comercialmente têm facilitado o desenvolvimento de novas abordagens para a investigação e aplicações clínicas 22,29. Além disso, estudos recentes que compararam geração de DC a partir de métodos de aderência de monócitos e tecnologia MACS têm demonstrado uma maior pureza DC e viabilidade usando MACS monócitos 22,30 separados.
Os presentes estudos atuaisuma comparação entre dois métodos para a geração de DC humanas a partir de monócitos isolados a partir de PBMC: 1) isolamento de monócitos por adesão e 2) isolamento de monócitos por selecção negativa utilizando um kit comercial de enriquecimento de monócitos humanos. Este estudo fornece evidências para mostrar que o processo de separação negativa selecção magnética para isolar monócitos gera o maior rendimento de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos, quando comparados com os monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. No geral, o presente estudo difere dos estudos anteriores referidos acima, uma vez que demonstra a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar e de se diferenciar em CD11c +MDDCs (> 70%) após sete dias em cultura, sem comprometer a sua viabilidade. Além disso, a abordagem actual fornece pela primeira vez caracterização de diferentes populações CD11c / CD14 MDDCs por citometria de fluxo de imagem.
Em resumo, uma vez que as DCs desempenhar um papel central em relação à investigação no domínio da imunologia, diferentes parâmetros devem ser tomadas em consideração quando se considera como eles são derivados e métodos que são utilizados para isolar e cultivar-los in vitro. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer informações em dois métodos diferentes de isolamento de monócitos e como esses métodos afetam diferencialmente viabilidade de monócitos e de rendimento, eventualmente, afetar a viabilidade das células dendríticas, proliferação e fenótipo. Estes resultados irão contribuir significativamente para o campo da imunologia e irá proporcionar um protocolo detalhado de DC isolamento, purificação, e caracterização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com base nas dificuldades conhecidas de isolar e gerando MDDCs de sangue humano, o presente estudo teve como objetivo fornecer uma comparação global dos dois métodos bem estabelecidos para a geração de MDDCs. O primeiro método de comparação é um método tradicional bem estabelecida para gerar MDDCs, explorando a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é rápido e de baixo custo, e não requer o uso de equipamento comple…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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