Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
On décrit une méthode par laquelle quantique point (QD) nanoparticules peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatifs de tissu pathologie humaine à l'aide de la microscopie optique de fluorescence Widefield et la microscopie électronique à transmission (MET). Pour démontrer le protocole que nous avons immuno-sections époxy ultrafines de tumeur somatostatinome humaine en utilisant un anticorps primaire à la somatostatine, suivi d'un anticorps secondaire biotinylé et visualisation avec de la streptavidine conjuguée à 585 nm, de cadmium et de sélénium (CdSe) points quantiques (QD). Les sections sont montées sur une grille d'échantillon TEM ensuite placé sur une lame de verre pour l'observation par microscopie optique à champ large de fluorescence. La microscopie optique révèle 585 nm marquage QD comme la fluorescence orange vif formant un motif granuleux dans le cytoplasme des cellules tumorales. Au bas de milieu de gamme de grossissement par microscopie optique du motif de marquage peut être facilement reconnu et le niveau de marquage non spécifique ou de fond évaluée. Ceci est un importantl'étape d'interprétation ultérieure du motif immunomarquage par TEM et de l'évaluation du contexte morphologique. La même section est ensuite épongé sec et vu par TEM. sondes QD sont vus pour être attaché à un matériau amorphe contenue dans les granules sécrétoires individuels. Les images sont acquises de la même région d'intérêt (ROI) vu par microscopie optique pour l'analyse corrélative. Correspondant des images de chaque modalité peut ensuite être mélangés pour superposer des données de fluorescence sur TEM ultrastructure de la région correspondante.
Introduction
Éclairage corrélative et la microscopie électronique (CLEM) est une approche puissante pour l'analyse des événements dynamiques transitoires 1, les événements rares 2, 3 et complexes systèmes 4. Il existe de nombreuses permutations techniques différentes disponibles 5 en fonction de la question posée mais une exigence commune est que la même structure dans un seul échantillon 6 est imagé par de multiples modalités de microscopie. Notre approche particulière de CLEM a été développé pour l'étude des tissus d' archives de pathologie humaine et le cas utilisé ici a été bien caractérisé et publié précédemment 7. L'objectif était d'une part, de maximiser les données analytiques à partir d'une seule biopsie ou un échantillon chirurgical et d'autre part, d'utiliser la microscopie optique de fluorescence pour aider à clarifier le contexte du modèle de marquage immunocytochimique vu au niveau ultrastructural.
nanocristaux de points quantiques (PQ) offrent la possibilité d'un système marqueur universel able à être considéré par les deux, la microscopie optique de fluorescence et microscopie électronique 8, 9, 10. Leur structure de noyau cristallin permet QDs de tailles différentes pour produire une large gamme de pics d'émission de fluorescence lorsqu'il est excité par la lumière à des longueurs d' onde loin de leurs spectres d'émission 11. Leur poids atomique est suffisante pour produire la densité électronique détectable par microscopie électronique à transmission, la microscopie électronique à balayage par transmission (STEM) ou par microscopie électronique à balayage à émission de champ. Ils sont particulièrement adaptés à des études immunocytochimiques que même BQs uniques peuvent être observées donnant une sensibilité ultime d'une QD par molécule cible 12. En outre, selon le QD utilisé, ils peuvent posséder une signature élémentaire individuelle approprié pour la cartographie.
Des échantillons de pathologie humaine offrent des avantages importants pour la recherche biomédicale translationnelle. des échantillons de tissus chirurgicaux et biopsie sont régulièrement soumis à des biobanques et appropéthique RIATE autorisations sont accessibles pour des études de recherche. Le tissu humain n'a pas les questions de pertinence ou de l' interprétation qui peuvent se produire chez l' animal ou dans des modèles in vitro de la maladie. Cependant, la préparation des échantillons d'échantillons de pathologie est souvent pas optimale. Il peut y avoir de retard dans le tissu étant placé dans un fixateur, fixateur inapproprié utilisé, tel que la formaline plutôt que glutaraldéhyde pour TEM et de l'échantillonnage inapproprié. CLEM méthodes ont la possibilité d'optimiser l'information diagnostique et pronostique disponible à partir d'un seul échantillon humain. Cependant, certaines approches corrélatives nouvellement développés tels que ceux utilisant un mini générateur d'oxygène singulet (miniSOG) ne sont pas disponibles pour une utilisation en pathologie en raison de la nécessité de la balise pour être génétiquement codée dans la cellule d'intérêt 13. Pour cette raison, nous avons exploré l'utilité de l'étiquetage QD du tissu TEM régulièrement préparé pour les études immunocytochimiques corrélatifs. QDs appliquée à l'époxy gravé ou sections de résine acrylique de lides échantillons de biopsie et de tissus ghtly aldéhyde fixes offrent la possibilité d'obtenir la microscopie optique de fluorescence corrélative et les données TEM à partir d'un seul échantillon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude a démontré l'utilité potentielle des QDs comme sondes universelles pour les études de CLEM. Les 585 nanoparticules nm QD utilisées ont montré une fluorescence brillante et stable lorsqu'elle est vue par microscopie optique à champ large et ont été facilement observés par MET. Une étude précédente par l' un des auteurs présents a montré QDs aussi être adapté à la microscopie optique super-résolution 7. Leur photostabilité a été particulièrement utile pour des pé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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