מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
שיטה מתוארת לפיה נקודה קוונטית (QD) חלקיקים יכולים לשמש ללימודי immunocytochemical גומלים של רקמות הפתולוגיה אנושיות באמצעות מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM). כדי להדגים את הפרוטוקול לנו immunolabeled סעיפי אפוקסי ultrathin של גידול somatostatinoma האנושי באמצעות נוגדן ראשוני סומטוסטטין, ואחריו נוגדנים משני biotinylated ויזואליזציה עם מצומדות streptavidin 585 ננומטר קדמיום-סלניום (CdSe) נקודות קוונטיות (QDs). הסעיפים הם רכובים על רשת הדגימה TEM ממוקם אז בשקופית זכוכית להסתכלות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי widefield. במיקרוסקופ אור מגלה תיוג QD 585 ננומטר כמו קרינה כתומה בהירה ויוצרת דפוס נקודתית בתוך הציטופלסמה התאים הסרטניים. בשעה נמוכה הגדלה אמצע טווח על ידי מיקרוסקופ אור דפוס התיוג ניתן להכיר בקלות את רמת התיוג שאינו ספציפי או רקע העריכה. זהו קריטיצעד לפרשנות הבאה של דפוס immunolabeling ידי TEM וערכה של ההקשר מורפולוגיים. הסעיף אותו דבר ואז מחק יבש שנצפה על ידי TEM. בדיקות QD נראות תצורפנה חומר אמורפי כלול גרגרי פרשת פרט. תמונות נרכשות מאותו האזור של (ROI) העניין לראות על ידי מיקרוסקופ אור לניתוח גומל. מקביל תמונות מודליות כל יכול אז להיות מעורבב כדי כיסוי נתוני קרינה על ultrastructure TEM של האזור המתאים.
Introduction
אור גומל במיקרוסקופ אלקטרונים (קלם) הוא גישה חזקה לניתוח אירועים דינמיים חולפים 1, 2 אירועים נדירים, 3 ומורכב 4 מערכות. יש תמורות רבות טכניות שונות זמינות 5 תלויים השאלה נשאלת אולם דרישה נפוצה היא כי אותו המבנה יחיד מדגם 6 הוא צלם ידי שיטות מיקרוסקופיה מרובות. הגישה שלנו בפרט כדי קלם פותחה לחקר רקמות הפתולוגיה האנושית ארכיוני והמקרה משמש כאן כבר מאופיין היטב שפורסמו בעבר 7. המטרה הייתה קודם כל, על מנת למקסם את הנתונים אנליטיים מ ביופסיה אחת או מדגם כירורגית ושנית, להשתמש במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי כדי לעזור להבהיר את ההקשר של דפוס תיוג immunocytochemical לראות ברמת ultrastructural.
nanocrystals נקודה קוונטית (QDs) מציעה את הפוטנציאל של ABL מערכת סמן אוניוורסלידואר כדי שיוצג על ידי שניהם, מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי במיקרוסקופ האלקטרונים 8, 9, 10. מבנה ליבת הגבישים שלהם מאפשר QDs בגדלים שונים כדי ליצור מגוון רחב של פסגות פליטת קרינה כאשר ירגש על ידי אור באורכי גל רחוק ספקטרום הפליטה שלהם 11. המשקל האטומי שלהם מספיק כדי להניב צפיפות אלקטרונים כי ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סריקה (STEM) או במיקרוסקופ אלקטרוני סורק פליטת שדה. הם מתאימים במיוחד ללימודי immunocytochemical כמו QDs האחת אפילו אפשר לראות מתן רגישות אולטימטיבית של QD אחד לכל מולקולת יעד 12. יתר על כן, תלוי QD בשימוש הם יכולים להחזיק חתימת יסודות פרט מתאימה למיפוי.
דגימות לפתולוגיה אדם להציע יתרונות משמעותיים למחקר ביו translational. דגימות רקמות ביופסיה כירורגית מוגשים באופן שגרתי עבור biobanking ועם appropניתן לגשת אתיקה סיווג riate ללימודי מחקר. רקמה אנושית אין בעיות של שייכות או פרשנות שיכול להתרחש חיים או במודלים חוץ גופית של המחלה. עם זאת, הכנת דגימה של דגימות לפתולוגיה לעתים קרובות אינה אופטימלית. לא יכול להיות עיכוב ברקמה שיוצב מקבע, מקבעים הולם בשימוש כגון פורמלין ולא glutaraldehyde עבור TEM ודגימה הולמת. יש שיטות קלם הפוטנציאל לייעל את מידע אבחון פרוגנוסטיים זמין ממדגם אנושי אחת. עם זאת, כמה גישות מצטרף חדש שפותחו כגון אלה העסקה מחולל חמצן גופייה מיני (miniSOG) אינן זמינות לשימוש פתולוגיה בשל הצורך עבור התג להיות מקודדים גנטיים לתוך תא העניין 13. מסיבה זו אנו בחנו את התועלת של תיוג QD של רקמות TEM מוכנות שגרתי ללימודי immunocytochemical גומלים. QDs להחיל אפוקסי חרוט או חלקים שרף אקרילי מ lightly אלדהיד דגימות ביופסיה ורקמות קבועים להציע את האפשרות לקבל מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי גומל ונתוני TEM ממדגם יחיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה הוכיח את התועלת הפוטנציאלית של QDs כמו בדיקות אוניברסליות ללימודים קלם. חלקיקי QD 585 ננומטר בשימוש הראו קרינה בהירה ויציבה כאשר נצפים על ידי מיקרוסקופ אור widefield ונצפו בקלות על ידי TEM. מחקר קודם על ידי אחד הסופרים הנוכחי הוכיח QDs גם להיות מתאים מיקרוסקופ אור סופר-ר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
