Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
kuantum noktası (QD) nanopartiküller Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile insan patolojisinde doku bağıntılı immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabilir ve böylece bir yöntem tarif edilmektedir. streptavidin konjüge 585 nm kadmiyum selenyum (CdSe) kuantum noktaları (QDS) ile biyotinlenmiş sekonder antikor ve görüntüleme ile, takiben de somatostatin birincil antikor kullanılarak, insan somatostatinoma tümör ultra-ince epoksi bölümleri immunolabeled olan protokolü, göstermek için. Kesitler daha sonra Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ile, gözlem için bir cam lam üzerine yerleştirilir TEM numune ızgara üzerine monte edilmiştir. Işık mikroskopisi tümör hücre sitoplazması içinde bir zerre desen oluşturan parlak turuncu floresan gibi 585 nm QD etiketleme ortaya koymaktadır. ışık mikroskobu ile orta menzilli büyütme düşük at etiketleme desen kolayca kabul edilebilir ve non-spesifik ya da arka plan etiketleme düzeyi değerlendirilir. Bu kritikmorfolojik bağlamda sonraki TEM ile immün desen yorumlanması ve değerlendirilmesi için adım. Aynı bölüm daha sonra kuru lekelenen ve TEM tarafından görülüyor. QD problar bireysel ifrazi tanecikler içerisinde bulunan şekilsiz malzemeye bağlı olmak görülmektedir. Görüntüler bağıntılı analizi için ışık mikroskobu ile görülen faiz (ROI) aynı bölgeden elde edilir. Her modalite görüntüleri mukabil sonra ilgili bölgenin TEM ultrastrüktürü floresan verilerini bindirmek için karışık olabilir.
Introduction
Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) geçici dinamik olaylara 1, nadir olaylar 2, 3 ve karmaşık sistemler 4 analizi için güçlü bir yaklaşımdır. Sorusuna bağlı olarak 5 mevcuttur birçok farklı teknik permütasyon isteniyor vardır ancak ortak bir gereksinim tek bir örnek 6 aynı yapı birden mikroskopi modaliteleri tarafından görüntülenmiş olmasıdır. Clem bizim özel yaklaşım, arşiv insan patolojisinde dokusunun çalışma ve iyi karakterize edilmiş ve 7, daha önce yayınlanmış olan burada kullanılan durum için geliştirilmiştir. Amaç ultrastrüktürel düzeyde görülen İmmünositokimyasal etiketleme desen bağlamını netleştirmeye yardımcı olmak için floresan ışık mikroskobu kullanımı, ikincisi tek biyopsi veya cerrahi örnek ve analitik verileri en üst düzeye çıkarmak, öncelikle oldu.
Kuantum nokta nanokristaller (QD'lerin) evrensel bir işaret sistemi abl potansiyel sunmaktadırE, her iki tarafından izlenmek üzere, floresan ışık ve elektron mikroskopi 8, 9, 10. kristalin çekirdek yapısı emisyon spektrumları 11 uzak dalga boylarında ışık ile uyarıldığında, farklı boyutlarda QDS floresans emisyon tepe geniş oluşturmasına olanak sağlar. Atom ağırlığı transmisyon elektron mikroskopisi, tarama elektron mikroskopisi (STM) ya da alan emisyonu tarama elektron mikroskopisi ile tespit edilebilir, elektron yoğunluğu elde etmek için yeterlidir. Hatta tek QDS hedef moleküle 12 başına bir QD nihai bir duyarlılık veren gözlenmiştir edilebilir Özellikle immünositokimyasal çalışmalar için uygundur. Ayrıca, QD bağlı onlar haritalama için uygun bir bireysel element imza sahip olabilir kullanılır.
İnsan patoloji örnekleri translasyonel biyomedikal araştırmalar için önemli faydalar sunar. Cerrahi doku ve biyopsi örnekleri rutin biobanking ve approp ile gönderilenyaklaşımlarına yön etik açıklıklar araştırma çalışmaları için erişilebilir. İnsan doku hayvandaki veya hastalığın in vitro modellerinde oluşabilir alaka ya yorumlama sorunları yok. Ancak, patoloji örneklerinin numune hazırlama genellikle optimal değildir. dokuda gecikme sabitleştirici konuyor olabilir, uygunsuz sabitleyici gibi TEM ve uygunsuz örnekleme için formalin yerine glutaraldehit olarak kullandı. CLEM yöntemler tek bir insan numuneden temin tanısal ve prognostik bilgi optimize etmek için bir potansiyele sahiptir. Ancak, bu tür küçük Singlet Oksijen Jeneratör (miniSOG) kullananlar gibi bazı yeni geliştirilen karşılıklı yaklaşımlar nedeniyle etiket genetik ilgi 13 hücreye kodlanacak için ihtiyaç patoloji kullanılmak üzere mevcut değildir. Bu nedenle biz karşılıklı immünositokimyasal çalışmalar için rutin olarak hazırlanan TEM dokusunun QD etiketleme programı incelemiş bulunuyoruz. QDS kazınmış epoksi veya Li'den akrilik reçine bölümlere uygulananghtly aldehit sabit biyopsi ve doku örnekleri tek bir örnekten bağıntılı floresan ışık mikroskobu ve TEM veri elde etmek imkanı sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma CLEM çalışmaları için evrensel prob olarak QDS potansiyel yarar göstermiştir. Geniş açılı ışık mikroskobu ile inceledi ve kolayca TEM gözlendi kullanılan 585 nm QD nanopartiküller parlak ve istikrarlı floresan gösterdi. Mevcut yazarlardan birinin bir önceki çalışmada da süper çözünürlük ışık mikroskobu 7 için uygun olduğu QD'lerin göstermiştir. Onların fotostabilite genişletilmiş izleme süreleri ve uzun görüntüleme pozlama için özellikle yararlı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
