المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
ووصف طريقة حيث الكم نقطة (QD) النانوية يمكن أن تستخدم للدراسات immunocytochemical المترابطة من الأنسجة علم الأمراض البشرية باستخدام widefield مضان المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني انتقال (تيم). للتدليل على بروتوكول قمنا immunolabeled أقسام الايبوكسي سامسونج الورم ورم سوماتوستاتيني البشري باستخدام الأجسام المضادة الأولية لالسوماتوستاتين، تليها الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز والتصور مع streptavidin مترافق 585 نانومتر الكادميوم والسيلينيوم (سيلينيد الكادميوم) نقاط الكم (نقاط الكمية). هي التي شنت المقاطع على تيم شبكة عينة ثم توضع على شريحة زجاجية للمراقبة من قبل widefield المجهر الضوئي مضان. المجهر الضوئي تكشف عن 585 نانومتر QD وضع العلامات، مضان برتقالية زاهية تشكيل نمط محبب داخل سيتوبلازم الخلية السرطانية. في منخفض للتضخم متوسطة المدى بواسطة المجهر الضوئي نمط العلامات يمكن التعرف عليه بسهولة ومستوى وضع العلامات غير محددة أو خلفية تقييمها. هذا هو حرجةخطوة للتفسير لاحق من نمط immunolabeling بواسطة تيم وتقييم سياق الصرفي. ونشف القسم نفسه ثم الجافة وينظر إليها من قبل تيم. وينظر تحقيقات QD لضمها الى مواد غير متبلور الواردة في حبيبات إفرازية الفردية. يتم الحصول على الصور من نفس المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي اطلعت عليها المجهر الضوئي لتحليل مترابط. المقابلة الصور من كل طريقة قد تكون ثم المخلوطة لتراكب البيانات مضان على تيم التركيب الدقيق للمنطقة المقابلة.
Introduction
ضوئية مترابط والمجهر الإلكتروني (كليم) هو طريقة فعالة لتحليل أحداث دينامية عابرة 1، والأحداث النادرة 2 و 3 و معقدة أنظمة 4. هناك العديد من التباديل التقنية المختلفة المتاحة 5 اعتمادا على السؤال المطروح ولكن شرط شيوعا هو أن نفس هيكل في عينة واحدة 6 وتصوير بطرائق المجهر متعددة. وقد وضعت لدينا نهج معين لكليم لدراسة أرشيفية الأنسجة أمراض الإنسان وقضية المستخدمة هنا اتسمت بشكل جيد ونشرت سابقا 7. وكان الهدف أولا، إلى تحقيق أقصى قدر من البيانات التحليلية من خزعة واحدة أو عينة جراحية، وثانيا، لاستخدام ضوء مضان المجهر للمساعدة في توضيح سياق نمط العلامات immunocytochemical ينظر في مستوى التركيبية.
البلورات النانوية نقطة الكم (نقاط الكمية) توفر إمكانات علامة عالمية ABL النظامالبريد ليتم عرضه من قبل كل من، وعلى ضوء مضان المجهر والمجهر الإلكتروني 8 و 9 و 10. هم الهيكل الأساسي البلورية يسمح نقاط الكمية من أحجام مختلفة لتوليد مجموعة واسعة من قمم مضان الانبعاثات عند اثارته ضوء بأطوال موجية بعيدا عن أطياف انبعاثاتها 11. وزنها الذري كافية لانتاج كثافة الإلكترونات التي يمكن كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ، المجهر الإلكتروني النافذ (STEM) أو انبعاث المجال المجهر الإلكتروني. وهي مناسبة بشكل خاص للدراسات immunocytochemical حتى نقاط الكمية واحدة يمكن ملاحظة يعطي حساسية في نهاية المطاف من QD واحد لكل جزيء الهدف 12. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على QD استخدامها يمكن أن تمتلك توقيع عنصر الفردية مناسبة لرسم الخرائط.
عينات أمراض الإنسان تقدم فوائد كبيرة للبحوث الطبية الحيوية متعدية. وقدم عينات الأنسجة الجراحية وخزعة بشكل روتيني لالبنوك الحيوية ومع appropالأخلاق riate الموافقات يمكن الوصول للدراسات البحثية. لم يقم الأنسجة البشرية المسائل ذات الصلة أو التفسير الذي يمكن أن يحدث في الحيوان أو في نماذج المختبر من المرض. ومع ذلك، وإعداد عينة من عينات علم الأمراض في كثير من الأحيان ليس الأمثل. يمكن أن يكون هناك تأخير في الأنسجة التي توضع في تثبيتي، استخدم مثبت غير ملائمة مثل الفورمالين بدلا من غلوتارالدهيد لتيم وأخذ العينات غير لائقة. طرق كليم لديها القدرة على تحسين المعلومات التشخيصية والنذير المتاحة من عينة بشرية واحدة. ومع ذلك، بعض النهج المترابطة وضعت حديثا مثل تلك التي تستخدم مصغرة مولد القميص الأوكسجين (miniSOG) ليست متاحة للاستخدام في علم الأمراض بسبب الحاجة للعلامة إلى أن المشفرة وراثيا في الخلية من الفائدة 13. لهذا السبب يتعين علينا استكشاف جدوى وضع العلامات QD الأنسجة تيم أعدت بشكل روتيني للدراسات immunocytochemical المترابطة. تطبيق نقاط الكمية إلى الايبوكسي محفورا أو أقسام راتنج الاكريليك من لىخزعة والأنسجة عينات ghtly ألدهيد ثابتة توفر إمكانية الحصول على مترابط المجهر الضوئي مضان والبيانات تيم من عينة واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبتت هذه الدراسة الفائدة المحتملة من نقاط الكمية كما تحقيقات العالمية للدراسات كليم. وأظهرت النانوية نانومتر QD 585 تستخدم مضان مشرق ومستقر عند عرضها بواسطة المجهر الضوئي widefield ولوحظت بسهولة من قبل تيم. وقد أظهرت دراسة سابقة أجراها أحد مؤلفي الحالية نقاط الكمية أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
