Korrelative lys- og Electron Microscopy Brug Quantum Dot Nanopartikler
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
En fremgangsmåde er beskrevet, hvorved der kan anvendes quantum dot (QD) nanopartikler til korrelative immuncytokemiske studier af human patologi væv ved hjælp Vidvinklet fluorescens lysmikroskopi og transmissionselektronmikroskopi (TEM). For at demonstrere den protokol, vi har immunmærket ultratynde epoxy snit af human somatostatinoma tumor under anvendelse af et primært antistof til somatostatin, efterfulgt af et biotinyleret sekundært antistof og visualisering med streptavidin konjugeret 585 nm cadmium-selen (CdSe) quantum dots (QDs). Sektionerne er monteret på en TEM prøve gitter derefter anbragt på en glasplade til observation ved Vidvinklet fluorescens lysmikroskopi. Lysmikroskopi afslører 585 nm QD mærkning som klart orange fluorescens danner et granulært mønster i tumoren cellecytoplasmaet. Ved lav til mellemklassen forstørrelse ved lysmikroskopi mønstret mærkning kan let genkendes og niveauet af ikke-specifik eller baggrund mærkning vurderet. Dette er et kritisktrin til efterfølgende fortolkning af immunolabeling mønster ved TEM og evaluering af den morfologiske kontekst. Den samme sektion derpå duppet tørre og ses af TEM. QD sonder ses at være knyttet til amorft materiale, der er indeholdt i de enkelte sekretoriske granula. Billeder er erhvervet fra den samme region af interesse (ROI) set ved lysmikroskopi for korrelationsmaalinger analyse. Tilsvarende billeder fra hvert modalitet kan derefter blandet til overlejre fluorescensdata på TEM ultrastruktur af den tilsvarende region.
Introduction
Korrelative lys- og elektronmikroskopi (CLEM) er en kraftig tilgang til analyse af forbigående dynamiske begivenheder 1, sjældne begivenheder 2, 3 og komplekse systemer 4. Der er mange forskellige tekniske permutationer tilgængelige 5 afhængigt af spørgsmålet bliver stillet dog et fælles krav er, at den samme struktur i en enkelt prøve 6 afbildes af flere mikroskopi modaliteter. Vores særlig tilgang til CLEM blev udviklet for studiet af arkivering humant patologi væv og sagen anvendt her er blevet godt karakteriseret og offentliggjort tidligere 7. Formålet var dels at maksimere de analytiske data fra en enkelt biopsi eller kirurgisk prøve og for det andet, at bruge fluorescens lysmikroskopi at hjælpe med at afklare for rammerne af den immuncytokemiske mønster mærkning ses på ultrastrukturelle niveau.
Kvantepunkt nanokrystaller (QDs) giver mulighed for en universel markør-system able at blive set af både fluorescens lysmikroskopi og elektronmikroskopi 8, 9, 10. Deres krystallinske kernestruktur tillader QDs af forskellige størrelser til at generere et bredt spektrum af fluorescensemission toppe ved excitation med lys ved bølgelængder langt fra deres emissionsspektre 11. Deres atomvægt er tilstrækkelig til at give elektrontæthed, der kan påvises ved transmissionselektronmikroskopi, scanning transmission elektronmikroskopi (STEM) eller feltemissions scanningselektronmikroskopi. De er særligt velegnede til immuncytokemiske studier som selv individuelle QDs kan observeres hvilket giver en ultimativ følsomhed på én QD pr målmolekyle 12. Afhængigt af den QD brugte de kan have sit eget elementært signatur egnet til kortlægning.
Humane patologi prøver giver betydelige fordele for translationel biomedicinsk forskning. Kirurgisk væv og biopsiprøver rutinemæssigt forelægges til biobank og med appropriate etik frirum kan tilgås for forskningsundersøgelser. Humant væv har ikke spørgsmål af relevans eller fortolkning, der kan opstå i dyr eller in vitro-modeller for sygdom. Imidlertid prøvepræparation af patologiske prøver ofte ikke er optimal. Der kan være forsinkelse i vævet, der er placeret i fiksativ, uhensigtsmæssig fikseringsvæske anvendes, såsom formalin i stedet for glutaraldehyd i TEM og uhensigtsmæssig prøveudtagning. Clem metoder har potentiale til at optimere diagnostisk og prognostisk information er tilgængelig fra en enkelt human prøve. Men nogle nyudviklede korrelative tilgange såsom dem, der anvender mini Singlet Oxygen Generator (miniSOG) er ikke tilgængelige til anvendelse i patologi, på grund af behovet for det tag, der skal genetisk kodet ind i cellen af interesse 13. Derfor har vi undersøgt nytten af QD mærkning af rutinemæssigt forberedt TEM væv til korrelative immuncytokemiske studier. QDs påføres ætset epoxy eller akryl harpiks sektioner fra lightly aldehyd faste biopsi og vævsprøver tilbyder muligheden for at opnå korrelationsmaalinger fluorescens lysmikroskopi og TEM-data fra en enkelt prøve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse har vist potentiale nytte af QDs som universelle prober til Clem undersøgelser. De 585 nm QD nanopartikler, der anvendes viste lyse og stabil fluorescens, når set af Vidvinklet lysmikroskopi og blev let observeret af TEM. En tidligere undersøgelse af en af de foreliggende forfattere har vist QDs også at være egnet til super-opløsning lysmikroskopi 7. Deres fotostabilitet var særlig nyttige for udvidede visning perioder og lange billeddannende engagementer. QDs kan også anvendes til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
