Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Een werkwijze wordt beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische correlatieve studies van humane pathologie weefsel met behulp groothoek fluorescentie lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Het protocol wij epoxy ultradunne coupes van humane tumor somatostatinoma immunolabeled Een primair antilichaam tegen somatostatine, gevolgd door een gebiotinyleerd secundair antilichaam en visualisatie met streptavidine geconjugeerd 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QD) tonen. De secties zijn gemonteerd op een TEM monster raster vervolgens op een glasplaatje geplaatst voor observatie door groothoek fluorescentie licht microscopie. Lichtmicroscopie onthult 585 nm QD etikettering als fel oranje fluorescentie de vorming van een korrelige patroon binnen de tumorcel cytoplasma. Bij lage tot mid-range vergroting met lichtmicroscopie de etikettering patroon gemakkelijk kan worden herkend en het niveau van niet-specifieke of achtergrond labeling beoordeeld. Dit is een kritiekestap voor daaropvolgende interpretatie van de immunokleuring patroon met TEM en evaluatie van de morfologische context. In dezelfde paragraaf wordt vervolgens droog gedept en bekeken door TEM. QD probes gezien worden gehecht aan amorf materiaal op individuele secretoire granules. Beelden worden verkregen uit dezelfde regio van belang (ROI) gezien door lichtmicroscopie voor correlatieve analyse. Overeenkomstige beelden uit elke modaliteit kan dan worden vermengd om de fluorescentie gegevens overlay over TEM ultrastructuur van de betrokken regio.
Introduction
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een krachtige benadering voor de analyse van transiënte dynamische gebeurtenissen 1, zeldzame gebeurtenissen 2, 3 en complexe systemen 4. Er zijn veel verschillende technische permutaties beschikbaar 5 afhankelijk van de vraag gesteld echter een gebruikelijke voorwaarde is dat dezelfde structuur in een enkel monster 6 wordt afgebeeld door meerdere modaliteiten microscopie. De specifieke benadering Clem ontwikkeld voor de studie van archivistische humane pathologie weefsel en het geval gebruikt is goed gekarakteriseerd en eerder gepubliceerd 7. Het doel was enerzijds het analytische gegevens maximaliseren van een biopsie of chirurgische monster en ten tweede fluorescentie lichtmicroscopie gebruikt om duidelijk de context van de immunocytochemische markeringspatroon zien op het ultrastructurele niveau.
Quantum dot nanokristallen (QD's) bieden het potentieel van een universele marker systeem ABLe worden bekeken door zowel fluorescentie lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie 8, 9, 10. De kristallijne kernstructuur maakt QD van verschillende maten om uiteenlopende fluorescentie-emissie pieken genereren wanneer geëxciteerd door licht met golflengte ver van hun emissiespectra 11. Hun atoomgewicht volstaat de elektronendichtheid die detecteerbaar is door transmissie elektronenmicroscopie scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM) of veldemissie scanning elektronenmicroscopie verkregen. Ze zijn bijzonder geschikt voor immunocytochemische studies zelfs één QD worden waargenomen die een ultieme gevoeligheid van een QD per 12 doelmolecule. Bovendien lopen de QD gebruikt kunnen individuele elementaire handtekening geschikt voor kartering bezitten.
Human pathologie monsters bieden aanzienlijke voordelen voor translationeel biomedisch onderzoek. Chirurgische weefsel en biopsie monsters worden routinematig ingediend voor biobanking en met appropriate ethiek afstanden kunnen worden benaderd voor onderzoek studies. Menselijk weefsel niet kwesties van belang of de interpretatie die zich kunnen voordoen in het dier of in vitro modellen van de ziekte te hebben. Echter, prepareren pathologie monsters vaak niet optimaal. Er kunnen vertraging weefsel in fixeermiddel geplaatst, ongepaste fixatief zoals formaline plaats glutaaraldehyde TEM en ongepaste bemonstering. CLEM werkwijzen hebben het potentieel om de diagnostische en prognostische informatie van één menselijk monster optimaliseren. Sommige nieuw ontwikkelde correlatieve benaderingen zoals gebruik mini Singlet zuurstofgenerator (miniSOG) zijn niet beschikbaar voor gebruik in de pathologie vanwege de noodzaak voor de tag genetisch te coderen in de cel plaats 13. Daarom hebben we het nut van QD etikettering van routinematig bereid TEM correlatieve weefsel voor immunocytochemische studies onderzocht. QDs aangebracht op geëtste epoxy of acrylhars secties van liVerpakking goed aldehyde vaste biopsie en weefselmonsters bieden de mogelijkheid van het verkrijgen van correlatieve fluorescentie licht microscopie en TEM gegevens van een enkel monster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie heeft de potentiële bruikbaarheid van QD universele probes voor CLEM studies aangetoond. De 585 nm QD nanodeeltjes gebruikt toonde lichte en stabiele fluorescentie wanneer bekeken door groothoek licht microscopie en waren direct waargenomen door TEM. Een eerdere studie van een van de onderhavige auteurs aangetoond QD ook geschikt voor superresolutie lichtmicroscopie 7 zijn. Hun fotostabiliteit was vooral handig voor langere periodes bekijken en lange imaging belichtingen. QD kan ook worden gebrui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
