Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Un metodo è descritto quale quantum dot (QD) nanoparticelle possono essere utilizzati per studi correlativi immunocitochimiche di tessuto patologia umana utilizzando widefield microscopia a fluorescenza luce e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Per dimostrare il protocollo che abbiamo immunolabeled sezioni epossidiche ultrasottili di tumore somatostatinoma umano utilizzando un anticorpo primario per la somatostatina, seguito da un anticorpo secondario biotinilato e visualizzazione con streptavidina coniugata 585 nm cadmio-selenio (CdSe) punti quantici (QD). Le sezioni sono montati su una griglia esemplare TEM poi posto su un vetrino per osservazione da widefield microscopio ottico a fluorescenza. La microscopia ottica rivela 585 nm etichettatura QD come una fluorescenza arancio vivo formando un pattern granulare all'interno del citoplasma delle cellule tumorali. A bassa di mid-range di ingrandimento al microscopio ottico lo schema di etichettatura è facilmente riconoscibile e il livello di etichettatura non specifico o di sfondo valutata. Questo è criticopasso per successiva interpretazione del pattern immunomarcatura da TEM e valutazione del contesto morfologica. La stessa sezione è poi cancellato asciutto e visto da TEM. sonde QD sono visti da allegare al materiale amorfo contenute nei singoli granuli secretori. Le immagini vengono acquisite dalla stessa regione di interesse (ROI) visto al microscopio ottico per l'analisi correlativa. Corrispondente immagini da ogni modalità può poi essere miscelati per sovrapporre i dati di fluorescenza sulla TEM ultrastruttura della regione corrispondente.
Introduction
Light- Correlativo e microscopia elettronica (CLEM) è un approccio efficace per l'analisi di eventi dinamici transitori 1, eventi rari 2, 3 e complessi sistemi 4. Ci sono molti permutazioni tecniche differenti disponibili 5 a seconda della domanda che si pone tuttavia un requisito comune è che la stessa struttura in un singolo campione 6 è ripreso dalla modalità multiple microscopia. Il nostro approccio particolare CLEM stato sviluppato per lo studio del tessuto patologia umana archiviazione e il caso qui utilizzato è stato ben caratterizzati e pubblicato in precedenza 7. L'obiettivo era innanzitutto, per massimizzare i dati analitici da un'unica biopsia o campioni chirurgici e dall'altro, di utilizzare microscopia ottica a fluorescenza per chiarire contesto del modello di etichettatura immunocitochimica visto a livello ultrastrutturale.
nanocristalli quantum dot (QDs) offrono il potenziale di un marcatore universale abl di sistemae da osservare da entrambi, luce microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica 8, 9, 10. La loro struttura nucleo cristallino permette QD di diverse dimensioni per generare una vasta gamma di picchi di emissione di fluorescenza quando eccitato dalla luce a lunghezze d'onda lontano dalla loro spettri di emissione 11. Il loro peso atomico è sufficiente a produrre densità elettronica rilevabili mediante microscopia elettronica a trasmissione, microscopia a scansione elettronica a trasmissione (STEM) o emissione di campo microscopia elettronica a scansione. Sono particolarmente adatti per gli studi immunocitochimiche come anche i singoli QD possono essere osservati dando una sensibilità massima di un QD per molecola bersaglio 12. Inoltre, a seconda del QD utilizzato possono possedere una firma elementale individuale adatta per la mappatura.
campioni di patologia umana offrono vantaggi significativi per la ricerca biomedica traslazionale. campioni di tessuto chirurgica e la biopsia sono regolarmente presentate per biobanking e con appropetica riate distanze sono accessibili per studi di ricerca. Tessuto umano non ha problemi di rilevanza o di interpretazione che possono verificarsi in animali o in modelli in vitro di malattia. Tuttavia, la preparazione del campione dei campioni patologia spesso non è ottimale. Non ci può essere ritardo nel tessuto di essere immessi in fissativo, fissativo usato inadeguato quali formalina, piuttosto che glutaraldeide per TEM e campionamento inadeguato. metodi CLEM hanno il potenziale per ottimizzare le informazioni diagnostiche e prognostiche disponibili da un campione umano singolo. Tuttavia, alcuni approcci correlativi recente sviluppo come quelli che impiegano mini Generator ossigeno singoletto (miniSOG) non sono disponibili per l'uso in patologia a causa della necessità per l'etichetta da geneticamente codificato nella cella di interesse 13. Per questo motivo abbiamo esplorato l'utilità di etichettatura QD del tessuto TEM ordinariamente preparato per gli studi di immunocitochimica correlativi. QD applicato a resina epossidica acidato o sezioni resina acrilica da Licampioni di biopsia di tessuto e ghtly aldeide fissi offrono la possibilità di ottenere correlativa dati TEM microscopia a fluorescenza e da un singolo campione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio ha dimostrato la potenziale utilità di QD come sonde universali per gli studi CLEM. I 585 nm nanoparticelle QD utilizzati hanno mostrato fluorescenza brillante e stabile se visti al microscopio ottico widefield e sono stati prontamente osservati da TEM. Un precedente studio da uno dei presenti autori hanno dimostrato QD anche essere adatto a super-risoluzione microscopia ottica 7. La loro fotostabilità era particolarmente utile per periodi estesi e visualizzazione esposizioni di imaging lunghi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
