양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
양자점 (QD) 나노 입자가 위드 형광 광 현미경 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 인간의 병리 조직의 면역 세포 화학적 상호 연구에 사용될 수있다하는 방법을 설명한다. 스트렙 타비 딘 결합 585 nm의 카드뮴 – 셀레늄 (의 CdSe) 양자점 (양자점)과 바이오틴 차 항체 및 시각화 다음에 우리가 소마토스타틴 (somatostatin)에 대한 일차 항체를 사용하여 인간의 소마토스타틴 종양의 초박 에폭시 섹션을 immunolabeled 한 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 섹션 위드 형광 빛 현미경으로 관찰 유리 슬라이드 상에 배치 된 시료 TEM 그리드 상에 장착된다. 광학 현미경은 종양 세포 내의 세포질 과립 패턴을 형성 밝은 오렌지 형광으로서 585 나노 QD 라벨링을 보여준다. 광학 현미경에 의한 중간 범위에서 낮은 배율 표지 패턴을 쉽게 인식 할 수 있으며, 비특이적 또는 배경 라벨링의 수준을 평가. 이것은 중요하다형태 학적 맥락의 후속 TEM에 의해 immunolabeling 패턴의 해석과 평가 단계. 같은 부분은 건조 도말 및 TEM으로 볼 수 있습니다. QD 프로브는 개별 분비 과립에 포함되는 비정질 재료에 부착하는 것으로한다. 이미지는 상관 분석을위한 광학 현미경으로 볼 수이자 (ROI)의 같은 지역에서 취득. 각 양상에서 이미지를 대응하는 다음 해당 지역의 TEM의 미세 구조에 형광 데이터를 오버레이 배합 할 수있다.
Introduction
라이트 – 상관 및 전자 현미경 (클레멘 타인)의 과도 동적 이벤트 한 희귀 이벤트 2, 3, 4 복잡한 시스템의 분석을위한 강력한 방법이다. 질문에 따라 5 사용할 수 많은 다른 기술 순열 요청을 받고 있습니다 그러나 일반적인 요구 사항은 단일 샘플 6 동일한 구조가 여러 현미경 양식에 의해 촬영되어 있다는 것입니다. 클레멘 타인에 대한 우리의 특정 접근 방식은 보관 인간의 병리 조직의 연구 잘 특징과 7 이전에 게시 된 여기에 사용되는 경우에 개발되었다. 목적은 초 미세 구조 레벨에서 나타나는 면역 세포 표지 패턴의 내용을 명확하게하는 데 도움 형광 광학 현미경을 사용하여, 두 번째 단일 또는 외과 생검 샘플로부터 분석 된 데이터를 최대화하기 위해, 우선이었다.
양자점 나노 입자 (양자점)이 범용 마커 시스템 ABL의 가능성을 제공한다E는 모두 볼 수 있도록, 형광 광학 현미경 및 전자 현미경 (8, 9), (10). 이들 결정질 코어 구조들은 발광 스펙트럼 (11)까지의 파장의 광에 의해 여기 될 때 다른 크기의 양자점 형광 발광 피크의 넓은 범위를 생성 할 수있다. 이들 원자량은 투과형 전자 현미경, 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 또는 전계 방출 주사 전자 현미경으로 검출 가능한 전자 밀도를 수득하기에 충분하다. 심지어 하나의 양자점이 표적 분자 (12) 당 하나의 QD의 궁극적 인 감도를 제공 관찰 할 수 있으므로 그들은 특히 면역 세포 화학 연구에 적합하다. 또한, QD에 따라 그들이 매핑 적합한 개별 원소 서명을 가지고 사용될 수있다.
인간의 병리 샘플 번역 생물 의학 연구에 상당한 이점을 제공합니다. 수술 조직 및 생검 샘플을 정기적으로 biobanking과 approp로 제출riate 윤리 간극은 조사 연구에 액세스 할 수 있습니다. 인체 조직은 동물이나 질병의 체외 모델에서 발생할 수있는 관련성 또는 해석의 문제가 발생하지 않습니다. 그러나, 병리 샘플 시료 준비는 종종 최적이 아니다. 조직 지연 정착액에 배치되어있을 수 있습니다 부적절한 정착는 TEM 부적절한 샘플링 포르말린이 아닌 글루 타르 알데히드로 사용된다. 클레멘 타인 방법은 단일 샘플로부터 인간 가능한 진단 및 예후 정보를 최적화하기위한 가능성을 가지고있다. 그러나, 미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)를 이용하는 것과 같은 몇몇 새로 개발 상호 접근 인해 태그 관심 유전자 (13)의 셀에 부호화해야 할 필요성에 병리에서 사용할 수 없다. 이러한 이유로 우리는 상호 면역 세포 화학 연구에 일상적으로 준비 TEM 조직의 QD 라벨의 유틸리티를 살펴 보았다. 양자점은 에칭 에폭시 또는 리에서 아크릴 수지 섹션에 적용ghtly 알데히드 고정 생검 조직 샘플은 하나의 샘플에서 상호 형광 광 현미경 TEM 데이터를 획득 할 가능성을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 클레멘 타인의 연구를위한 범용 프로브로 양자점의 잠재적 인 유틸리티를 보여 주었다. 위드 광학 현미경으로 볼 수 있고 쉽게 TEM으로 관찰 할 때 사용하는 585 나노 양자점 나노 입자는 밝고 안정된 형광을 보였다. 본 저자 중 한 명으로 이전의 연구는 또한 초 고해상도 광학 현미경 (7)에 적합하도록 양자점을 보여 주었다. 이들의 광 안정성 확장 시청 기간과 긴 영상 노출에 특?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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