Samsvarende lys- og elektronmikroskopi Bruke Quantum Dot Nanopartikler
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
En fremgangsmåte er beskrevet hvorved quantum dot (QD) nanopartikler kan brukes til korrelerende immunocytokjemiske studier av human patologiske vev ved hjelp av vidfelt fluorescens-lys mikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). For å demonstrere den protokoll har vi immunolabeled ultratynne epoxy deler av human somatostatinoma tumor ved bruk av et primært antistoff til somatostatin, etterfulgt av en biotinylert sekundært antistoff og visualisering med streptavidin-konjugert 585 nm kadmium-selen (CdSe) kvanteprikker (QDS). Seksjonene er montert på en TEM-prøven gitter deretter plassert på et objektglass for observasjon av vidfelt fluorescens-lys mikroskopi. Lysmikroskopi avslører 585 nm QD merking som lys oransje fluorescens danner en granulær mønster i svulsten cellen cytoplasma. Ved lav til middels rekkevidde forstørrelse ved lysmikroskopi merking mønster lett kan gjenkjennes og nivået av ikke-spesifikk eller bakgrunn merking vurderes. Dette er en kritisktrinn for påfølgende tolkning av immunolabeling mønster ved TEM, og evaluering av den morfologiske sammenheng. Den samme delen er så blottet tørr og sett av TEM. QD prober er sett å være knyttet til amorft materiale som inneholdes i de enkelte sekretoriske granuler. Bildene er hentet fra den samme regionen av interesse (ROI) sett ved lysmikroskopi for samsvarende analyse. Tilsvarende bilder fra hver modalitet kan da være blandede å overlappe fluorescens data på TEM ultrastructure av tilsvarende region.
Introduction
Samsvarende lys- og elektronmikroskopi (CLEM) er en kraftfull tilnærming for analyse av forbigående dynamiske hendelser 1, sjeldne hendelser 2, 3 og komplekse systemer 4. Det finnes mange ulike tekniske variasjoner som er tilgjengelige 5 avhengig av spørsmål blir stilt imidlertid et vanlig krav er at den samme struktur i en enkelt prøve 6 avbildes av flere mikroskopi modaliteter. Vår bestemt tilnærming til CLEM ble utviklet for studiet av arkiv menneskelig patologi vev og saken er brukt her har blitt godt preget og utgitt tidligere 7. Målet var for det første, for å maksimere de analytiske data fra en enkelt biopsi eller kirurgisk prøve og for det andre å bruke fluorescens lysmikroskopi for å bidra til å klargjøre rammen av immunocytokjemisk merking mønster sees på ultra nivå.
Quantum dot nanokrystaller (QDS) har potensial til en universell markør system able for å bli sett av begge, fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi 8, 9, 10. Deres krystallinske kjernestruktur tillater QDS av forskjellige størrelser for å generere et bredt spekter av fluorescens-emisjonstoppene når det påvirkes av lys ved bølgelengder langt fra deres emisjonsspektra 11. Deres atomvekt er tilstrekkelig til å gi elektrontettheten som er detekterbar ved transmisjonselektronmikroskopi, scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) eller feltavgi scanning elektronmikroskopi. De er spesielt egnet til immunocytokjemiske studier som selv enkelt QDS kan observeres gi en endelig følsomhet på en QD per målmolekyl 12. Videre, avhengig av QD brukte de kan ha en enkelt elementært signatur egnet for kartlegging.
Menneskepatologiprøver gi betydelige fordeler for translasjonell biomedisinsk forskning. Kirurgisk vev og biopsiprøver blir rutinemessig sendt inn for biobanker og med hensiktskan nås klareringer messig etikk for forskningsstudier. Menneskelig vev har ikke problemer med relevans eller tolkning som kan oppstå i dyr eller in vitro modeller av sykdom. Men prøven utarbeidelse av patologiprøver ofte ikke optimal. Det kan være forsinkelse i vev blir plassert i fiksativ, upassende fikseringsmiddel anvendes, slik som formalin i stedet for glutaraldehyd for TEM og upassende prøvetaking. Clem metoder har potensial til å optimalisere diagnostisk og prognostisk informasjon som er tilgjengelig fra et enkelt menneske prøve. Men noen nyutviklede trene seg tilnærminger slik som de ansette mini singlet oksygen Generator (miniSOG) ikke er tilgjengelig for bruk i patologi på grunn av behovet for tag å være genetisk kodet inn i cellen av interesse 13. Av denne grunn har vi utforsket nytten av QD merking av rutinemessig forberedt TEM vev for samsvar immunocytokjemiske studier. QDS påført etset epoxy eller akryl harpiks seksjoner fra lightly aldehyd faste biopsi og vevsprøver gir mulighet til å få trene seg fluorescens lysmikroskopi og TEM data fra en enkelt prøve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien har vist potensialet nytten av QDS som universelle prober for Clem studier. De 585 nm QD nanopartikler brukes viste lyse og stabil fluorescens når sett av vidfelt lysmikroskopi og ble lett observert av TEM. En tidligere studie av en av de foreliggende forfatterne har vist QDS også å være egnet for super-oppløsning lysmikroskopi 7. Deres fotostabilitet var spesielt nyttig for lengre perioder som ser og lange bilde eksponeringer. QDS kan også brukes for multiplex immunhistokjemi med forskjel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
