Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Se describe un método por el cual las nanopartículas punto cuántico (QD) pueden ser utilizados para estudios de inmuno correlativos de tejido patología humana utilizando fluorescencia de campo amplio microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para demostrar el protocolo hemos immunolabeled secciones ultrafinas epoxi de tumor somatostatinoma humano usando un anticuerpo primario a la somatostatina, seguido de un anticuerpo secundario biotinilado y estreptavidina conjugada con la visualización 585 nm cadmio-selenio (CdSe) puntos cuánticos (QD). Las secciones se montan sobre una rejilla de muestras TEM luego se coloca en un portaobjetos para su observación por microscopía óptica de campo amplio de fluorescencia. Microscopía de luz revela 585 nm etiquetado QD como fluorescencia naranja brillante formando un patrón granular en el citoplasma de células tumorales. A baja a la ampliación de gama media por microscopía de luz del patrón de marcación se puede reconocer fácilmente y el nivel de etiquetado no específica o de fondo evaluó. Esta es una críticapaso para la posterior interpretación del patrón immunolabeling por TEM y la evaluación del contexto morfológico. En la misma sección A continuación, se secó con papel secante y visto por TEM. QD sondas se ven para ser unido a un material amorfo contenido en gránulos de secreción individuales. Las imágenes se adquieren de la misma región de interés (ROI) que se observa al microscopio óptico para el análisis correlativo. Correspondiente imágenes de cada modalidad puede ser entonces mezclado para superponer los datos de fluorescencia en TEM ultraestructura de la región correspondiente.
Introduction
Light- correlativa y microscopía electrónica (CLEM) es un enfoque poderoso para el análisis de eventos dinámicos transitorios 1, eventos raros 2, 3 y complejos sistemas 4. Hay muchas permutaciones diferentes técnicas disponibles 5 dependiendo de la cuestión que se plantea sin embargo un requisito común es que la misma estructura en una sola muestra 6 se forma la imagen de múltiples modalidades de microscopía. Nuestro enfoque particular de CLEM fue desarrollado para el estudio de los tejidos patología humana de archivo y el caso utilizado aquí ha sido bien caracterizado y publicado previamente 7. El objetivo era, en primer lugar, para maximizar los datos analíticos de una sola biopsia o pieza quirúrgica y en segundo lugar, utilizar la microscopía de luz fluorescente para ayudar a aclarar el contexto del patrón de etiquetado inmuno visto a nivel ultraestructural.
nanocristales de puntos cuánticos (QDs) ofrecen el potencial de un marcador universal de ABL del sistemae para ser visto por ambos, el microscopio óptico de fluorescencia y microscopía electrónica de 8, 9, 10. Su estructura núcleo cristalino permite puntos cuánticos de diferentes tamaños para generar una amplia gama de picos de emisión de fluorescencia cuando es excitado por la luz en longitudes de onda lejos de su espectro de emisión 11. Su peso atómico es suficiente para producir la densidad de electrones que es detectable por microscopía electrónica de transmisión, microscopía de barrido electrónico de transmisión (STEM) o microscopía electrónica de barrido de emisión de campo. Ellos son particularmente adecuados para inmuno estudios que se pueden observar incluso puntos cuánticos individuales dando una sensibilidad máxima de una vez al día por cada molécula diana 12. Además, dependiendo de la QD utiliza pueden poseer una firma elemental individuo adecuado para el mapeo.
muestras de patología humanos ofrecen beneficios significativos para la investigación biomédica traslacional. muestras de tejido de biopsia quirúrgica y se someten rutinariamente para los bancos biológicos y con appropética piados espacios libres se puede acceder a los estudios de investigación. Tejido humano no tiene problemas de relevancia o interpretación que pueden producirse en animales o en modelos in vitro de la enfermedad. Sin embargo, la preparación de muestras de las muestras de patología a menudo no es óptima. No puede haber retraso en el tejido que se está colocada en fijador, fijador apropiado utilizar tal como formalina en lugar de glutaraldehido para TEM y muestreo apropiado. métodos CLEM tienen el potencial para optimizar la información de diagnóstico y pronóstico disponible a partir de una sola muestra humana. Sin embargo, algunos enfoques correlativos recientemente desarrollados tales como los que emplean Mini Generador Singlet Oxygen (miniSOG) no están disponibles para uso en la patología debido a la necesidad de la etiqueta a ser codificado genéticamente en la célula de interés 13. Por esta razón hemos explorado la utilidad de etiquetado QD de tejido TEM preparado de forma rutinaria para inmuno estudios correlativos. Aplicada a los puntos cuánticos epoxi grabado al agua fuerte o secciones de resina acrílica de limuestras de biopsias y tejidos ghtly aldehído fijos ofrecen la posibilidad de obtener correlativa microscopía de luz de fluorescencia y datos que el sistema de una sola muestra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio ha demostrado la utilidad potencial de los puntos cuánticos como sondas universales para los estudios de CLEM. Las nanopartículas de 585 nm QD utilizados mostraron fluorescencia brillante y estable cuando se observan con un microscopio óptico de campo amplio y fueron observados fácilmente por TEM. Un estudio previo realizado por uno de los presentes autores han demostrado también los puntos cuánticos para ser adecuado para super-resolución de la microscopía de luz 7. Su fotoest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
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