Korrelat Ljus- och elektronmikroskopi Använda Quantum Dot Nanopartiklar
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Ett förfarande beskrivs varvid kvant prick (QD) nanopartiklar kan användas för korrelativa immuncytokemiska studier av human patologi vävnad med användning av widefield fluorescens Ijusmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi (TEM). För att demonstrera det protokoll vi har immunolabeled ultratunna epoxi snitt av human somatostatinoma tumör med användning av en primär antikropp till somatostatin, följt av en biotinylerad sekundär antikropp och visualisering med streptavidin konjugerat 585 nm kadmium-selen (CdSe) kvantprickar (QDs). Sektionerna är monterade på en TEM prov rutnät placerades därefter på ett objektglas för observation genom widefield fluorescens Ijusmikroskopi. Ljusmikroskopi avslöjar 585 nm QD märkning som ljust orange fluorescens bildar en granulär mönster inom tumörcellens cytoplasma. Vid låga till förstoring mellannivå genom ljusmikroskop märkningsmönstret kan lätt att känna igen och graden av icke-specifik eller bakgrunds märkning bedömas. Detta är ett kritisktsteg för efterföljande tolkning av immunomärkning mönstret genom TEM och utvärdering av den morfologiska sammanhang. Samma avsnitt sedan blottas torr och ses av TEM. QD prober ses att fästas till amorft material ingår i separata sekretoriska granuler. Bilderna förvärvas från samma region av intresse (ROI) ses av ljusmikroskop för korrelat analys. Motsvarande bilder från varje modalitet kan sedan blandas för att överlagra fluorescensdata på TEM ultra av den berörda regionen.
Introduction
Korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) är en kraftfull metod för analys av transienta dynamiska händelser 1, sällsynta händelser 2, 3 och komplexa system 4. Det finns många olika tekniska varianter finns fem beroende på den fråga som ställdes dock ett vanligt krav är att samma struktur i ett enda prov 6 avbildas av flera mikroskopi metoder. Vår särskilt förhållningssätt till CLEM utvecklades för att studera arkiv mänsklig patologi vävnad och fallet används här har väl karakteriserats och tidigare publicerats 7. Syftet var dels att maximera de analytiska data från en enda biopsi eller kirurgiskt prov och för det andra att använda fluorescens ljusmikroskop för att klargöra samband med immuncytokemiska märkningsmönstret sett på ultra nivå.
Quantum prick nanokristaller (QDs) erbjuder möjligheten att en universell markörsystem able för att ses av båda, fluorescens Ijusmikroskopi och elektronmikroskopi 8, 9, 10. Deras kristallina kärnstruktur tillåter QDs av olika storlek för att generera ett brett spektrum av fluorescensemissionstoppar när den exciteras av ljus vid våglängder långt från deras emissionsspektra 11. Deras atomvikt är tillräcklig för att ge elektrontäthet som är detekterbar med hjälp av transmissionselektronmikroskopi, skanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) eller för fältemission svepelektronmikroskopi. De är särskilt lämpade för immuncytokemiska studier även enstaka QDs kan observeras ge en ultimat känslighet en QD per målmolekyl 12. Dessutom, beroende på QD använde de kan ha en individuell elementär signatur lämplig för kartläggning.
Mänskliga patologi prover erbjuder betydande fördelar för translationell biomedicinsk forskning. Kirurgisk vävnads och biopsiprov rutinmässigt lämnas för biobank och med appropriate etik spelrum kan nås för forskarstudier. Mänsklig vävnad har inte frågor av betydelse eller tolkning som kan uppstå i djur eller in vitro-modeller av sjukdomen. Det är dock extraktion av patologiprover ofta inte optimalt. Det kan vara fördröjning i vävnad placeras i fixativ används olämpligt fixativ såsom formalin snarare än glutaraldehyd för TEM och olämpligt provtagning. Clem metoder har potential att optimera diagnostisk och prognostisk information från en enda mänsklig prov. Men vissa nyutvecklade korrelativa metoder såsom de som använder mini Singlet Oxygen Generator (miniSOG) är inte tillgänglig för användning i patologi på grund av behovet av taggen för att vara genetiskt kodas in i cellen av intresse 13. Av denna anledning har vi undersökt nyttan av QD märkning av rutinmässigt beredd TEM vävnad för korrelat immuncytokemiska studier. QDs tillämpas på etsad epoxi eller akryl sektioner harts från lightly aldehyd fasta biopsi och vävnadsprover erbjuder möjligheten att erhålla korrelat fluorescens ljusmikroskopi och TEM-data från ett enda prov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie har visat den potentiella nyttan av QDs som universella prober för Clem studier. De 585 nm QD nanopartiklar som används visade ljusa och stabil fluorescens när ses av Vidvinkel ljusmikroskop och var lätt observeras av TEM. En tidigare studie av en av de föreliggande författare har visat QDs också vara lämpliga för superupplösning Ijusmikroskopi 7. Deras foto var särskilt användbart för längre visningstider och långa avbildningsexponeringar. QDs kan också användas för multiplex i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
