Summary
والأوتار المثنية في اليد أصيب عادة، مما يؤدي إلى اختلال وظائف اليد. ومع ذلك، يتم الاستجابة شفاء ندبة الأنسجة لا تتميز بشكل جيد. وأظهر نموذج الفئران الشفاء المثنية وتر هنا. هذا النموذج يمكن أن تعزز الفهم الشامل لعملية الشفاء، وتقييم أساليب علاجية لتحسين الشفاء.
Abstract
وتر يربط العضلات والهيكل العظمي والعظام، وتسهيل حركة ما يقرب من كامل الجسم. في اليد والأوتار العضلة القابضة (FTS) تمكن انثناء الأصابع واليد وظيفة عامة. إصابات في FTS شائعة، وغالبا ما يتم التئام مرضية بسبب ندبا الزائدة والتصاقات بين الوتر والأنسجة المحيطة بها. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن المكونات الجزيئية والخلوية للإصلاح FT. تحقيقا لهذه الغاية، وهذا نموذج الفئران من إصلاح FT الذي يلخص جوانب كثيرة للشفاء في البشر، بما في ذلك مجموعة وضعف الحركة ونقص الخصائص الميكانيكية، وقد وضعت وصفها سابقا. هنا يتم توفير مظاهرة في عمق هذا الإجراء الجراحي، التي تنطوي على transection وإصلاح لاحقة في وتر العضلة القابضة لأصابع إبهام اليد (إف دي إل) في مخلب هند الفئران. هذه التقنية يمكن استخدامها لإجراء تحليل النسب من أنواع مختلفة من الخلايا، وتقييم تأثير زيادة الجين أو فقدان وظيفة، ولاختبار ايفيcacy من التدخلات الدوائية في عملية الشفاء. ومع ذلك، هناك نوعان من القيود الأساسية لهذا النموذج: ط) وتر إف دي إل في منتصف جزء من مخلب هند الفئران، حيث تحدث transection والإصلاح، لا يحيط بها غمد الزليلي. لذلك هذا النموذج لا يأخذ في الحسبان إمكانية مساهمة غمد لعملية تشكيل ندبة. ب) لحماية سلامة الموقع إصلاح، يتم تحرير FT عند تقاطع myotendinous، وخفض القوات الميكانيكية للوتر، من المرجح أن تسهم في زيادة تكوين ندبة. وقد أثبتت عزل خلايا كافية من النسيج الحبيبي من FT أثناء عملية الشفاء لتحليل تدفق cytometric تحديا. علم الخلايا الطرد المركزي لتركيز هذه الخلايا هو أسلوب بديل المستخدمة، ويسمح لجيل من الاستعدادات الخلية التي مناعي وضع العلامات لا يمكن أن يؤديها. مع هذا الأسلوب، وتحديد حجم الخلايا أو البروتينات من الفائدة خلال الشفاء FT يصبح ممكنا.
Introduction
الأوتار المثنية في جهة العمل بالتنسيق مع العضلات الباسطة من الساعد والأغماد الرقمية لتمكين انثناء من الأرقام واستيعاب وظيفة اليد. الأوتار المثنية تشغيل على طول الجانب الراحي من اليد. هذا الموقع سطحية نسبيا غالبا ما يؤدي إلى إصابة الأوتار المثنية خلال صدمة في اليد. الأوتار شفاء من خلال استجابة ندبا بدلا من تجديد وتر العادي الأنسجة 1. في حين أن هذا ندبا توفر استمرارية لوتر، وظيفة وانخفض بشكل كبير نسبة إلى وتر صحي. وتتميز المركبة الأنسجة وتر-ندبة من قبل الخواص الميكانيكية اختلال 1، مما يجعل الأوتار إصلاحه أكثر عرضة للتمزق. وبالإضافة إلى ذلك، ندبا تفتقر إلى تنظيم وتر الكولاجين بنية الألياف الأصلي، مما أدى إلى زيادة في حجم وتر وبكميات كبيرة. ونظرا للقيود التشريحية وحدة وتر-غمد، وحتى زيادة متواضعة في حجم وتر يمكن الحمراء بشكل كبيرفوسي وظيفة مزلق للوتر، وبالتالي مجموعة مكونة من الحركة وظيفة اليد.
قبل إلى وقوع إصابات في عام 1960 إلى الأوتار المثنية، ولا سيما في المنطقة الثانية من جهة، لم إصلاحه بشكل روتيني بسبب مضاعفات خطيرة في تضميد الجراح التي نشأت مع هذه الإصلاحات 2. وقد أحيلت هذه المنطقة من ناحية باسم "المنطقة الحرام" 3. ومع ذلك، فإن التحسينات في التقنيات الجراحية، وأنماط خياطة والبروتوكولات إعادة التأهيل والعلاج الفيزيائي قد تحسنت بشكل كبير نتائج المثنية إصلاح وتر 2. وعلى الرغم من هذا التقدم، ما يصل إلى 40٪ من إصلاحات تؤدي إلى تشكيل التصاق كافية لإعاقة وظيفة اليد (4). لذلك، لا بد من نهج البيولوجي لتحسين الشفاء. للأسف، لا يعرف إلا القليل جدا عن عملية الشفاء وتر على المستوى الخلوي والجزيئي. وهكذا، كان الهدف هو تطوير نموذج الفئران التي يمكن استخدامها لتحسين التفهم الأساسيغرام من المكونات الخلوية والجزيئية لالمثنية الشفاء وتر واستجابة تشكيل ندبة، وذلك كوسيلة لتحديد أهداف علاجية جديدة لتحسين الشفاء.
وكانت النماذج الحيوانية أكبر دور فعال في تعزيز فهم عملية الشفاء المثنية وتر. وقد أثبتت الكلاب والأرانب دراسات كل من قدرة الشفاء الذاتية وخارجي الأوتار المثنية 5،6، على أهمية الحركة السلبية التي تسيطر عليها في وقت مبكر في التقليل من تشكيل التصاق بالنسبة لتجميد 7، فضلا عن آثار أنماط خياطة مختلفة على عملية الشفاء 8 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج الكلاب مفيدة في اختبار نهج النسيج الهندسة متعدية لتحسين الشفاء 10. ومع ذلك، هناك العديد من المزايا الهامة في استخدام نموذج الفئران بالنسبة لنموذج الحيوانات الكبيرة، بما في ذلك التكاليف النسبية، وتوفر الكواشف محددة الفئران، وسهولة توليد كنوك العالميأو يبني حذف / overexpression الأنسجة محددة الرافضة ك. وعلاوة على ذلك، فإن أوجه التشابه وظيفية بين الإنسان والفئران فيما يتعلق الأوتار المثنية 11 تشير إلى فائدة محتملة في تطوير نموذج الفئران.
تطوير نموذج الفئران من transection المثنية وتر وإصلاح يحاكي جوانب كثيرة من الشفاء السريري، بما في ذلك تشكيل وفيرة ندبا والخواص الميكانيكية ضعف. النموذج الذي وصفها هنا ليست خلاصة الحقيقي للممارسة السريرية بسبب transection من إف دي إل عند تقاطع myotendinous من أجل حماية الموقع إصلاح. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج لا يأخذ في الحسبان مساهمة خلايا غمد الزليلي للاستجابة الشفاء، حيث لا يوجد غمد الزليلي الذي يغطي منتصف جزء من وتر التي يحدث فيها إصلاح. وعلى الرغم من هذه القيود، وهذا النموذج في الاستفادة من مجموعة توليد الالتصاقات التي تحد الحركة، والذي لم يتم حتى الآن أثبتت في نماذج الفئران أن أكثر كلوساعل تقريب السيناريو السريري. وقد استخدم هذا النموذج لتقييم نماذج الماوس خروج المغلوب 12،13، واختبار النهج الدوائية المختلفة لتحسين الشفاء 14-17. تحليل النسيجي لهذا النموذج، وذلك باستخدام المناعية وفي الموقع التهجين، يمكن أن توفر معلومات هامة في لتوطين الجينات والبروتينات الأساسية أثناء الشفاء. ومع ذلك، توفر الأنسجة سوى التحليل المكاني مستعرضة ولا تسمح الكمي في جميع أنحاء الأنسجة بأكملها. التدفق الخلوي يمثل نهجا أكثر الكمي، ولكن فقط لعدد محدود جدا من الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة الشفاء وتر في نموذج الفأر، وانخفض هذا العدد مرة أخرى خلال خطوات التثبيت، permeabilization، والغسيل. أخذ هذا في الاعتبار ل، وتدفق يصبح الخلوي نهج غير عملي نظرا لعدد من الحيوانات التي ستكون مطلوبة. ضروري طريقة بديلة للحفاظ على غالبية هذه الفئة من السكان الخلايا الصغيرة من أجللمزيد من تميز الوسط الشفاء. الطريقة المستخدمة لتحقيق ذلك، كما هو موضح هنا، ينطوي على تركيز الخلايا المعزولة عن طريق الطرد المركزي الخلايا على شريحة زجاجية، تليها مناعية. في هذه الدراسة ايدو (5 إيثينيل-2'deoxyuridine، التناظرية ثيميدين) تم استخدام التأسيس ووضع العلامات لاحق لتحديد حالة التكاثري النسبية للخلايا في الموقع الشفاء. هذا النهج يمكن تطبيقها على اختبار فعالية من العلاجات الدوائية على تكاثر الخلايا، الجينات الضربة القاضية، أو overexpression، أو لتحديد وقياس السكان مختلفة من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة جامعة للبحوث الحيوان في جامعة روتشستر جميع التجارب على الحيوانات. / استخدمت 6J الفئران عشرة لمدة 12 أسبوعا من العمر C57BL الإناث.
1. إعداد الحيوانات لجراحة العضلة القابضة وتر (~ 15 دقيقة)
- الأدوات الجراحية الأوتوكلاف لتعقيم، وارتداء القفازات المعقمة في جميع أنحاء، والحفاظ على مجال التشغيل العقيمة.
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) مع حجم الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) المقابلة لوزن الجسم. تأكيد عمق التخدير عن طريق غياب منعكس إصبع القدم قرصة.
- إدارة التسكين وقائية (البوبرينورفين، ،05-،1 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد. تطبيق مرهم للعين لمنع العينين من الجفاف.
- إعداد موقع الجراحية التي تقليم الفراء على أطرافه الخلفية بأكمله. تعقيم الجلد عن طريق تنقية بالتتابع مع اليود البوفيدون، تليها 70٪ من الإيثانول، ومرة أخرى مع اليود البوفيدون.
معشوقة = "jove_title"> 2. الفئران العضلة القابضة وتر الإصابات وجراحة إصلاح (~ 10 دقيقة)
- العثور على العضلة القابضة لأصابع إبهام اليد (إف دي إل) وتر، وينظر بشكل سطحي في الجانب الأنسي من ربلة الساق. باستخدام مشرط، وجعل صغير 0.5-1 سم شق في الجلد مع مقص الجزئي لفضح وتر.
- استخدام ملقط لفصل وتر إف دي إل من الأنسجة المحيطة وتتبع ما يصل الى تقاطع myotendinous. قطع وتر في هذا التقاطع مع مقص الربيع الإفراج عنها، مع الحرص على تجنب الشريان الخلفي عظام الساق.
- إغلاق الجلد مع خيوط النايلون 5-0.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ transection إف دي إل وإصلاح (الخطوات 2،4) باستخدام مجهر تشريحي. - جعل شق 3 مم على الجانب posterolateral من مخلب هند باستخدام الربيع مقص الصغرى. سحب بلطف الأنسجة الناعمة المحيطة والعضلات مع ملقط، مع التأكد من تقليل تلف الأنسجة، والتعرف على وتر إف دي إل.
- رفع بلطف وتر إف دي إل والقطع تماما باستخدام ميلكرو-مقص. خياطة طرفي إف دي إل وتر معا في نمط كيسلر مع تعديل 8-0 الغرز، وتجنب جفاف وتر عن طريق تبليل بشكل دوري مع المياه المالحة.
- استبدال الأنسجة الرخوة والعضلات على وتر، ثم إغلاق شق مع 5-0 خيوط النايلون.
- وضع الفئران على شريحة مجموعة دفئا إلى 37 درجة مئوية، للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى تعافى من التخدير.
- مراقبة الفئران بعد العملية لعلامات ضعف أو الإصابة بما في ذلك زيادة اللفظ والفراء تكدرت. حقن البوبرينورفين (50 ميكرولتر / الماوس)، ومسكن كل 12 ساعة حتى الفئران لم تعد تظهر علامات الألم أو الضيق.
- السماح للفئران لعلاج لمدة 10 يوما بعد الجراحة قبل الاستمرار في الخطوات التالية.
ملاحظة: خلايا يمكن حصاده في أي وقت نقطة بعد الجراحة. هنا، يتم اختيار 10 يوما لهذه التجارب التمثيلية نظرا لالخلوية عالية نسبيا من الأنسجة في هذا الوقت.
3. Labeliنانوغرام من خلايا الدراجات (~ 10 دقيقة)
- إعداد ايدو (5 إيثينيل-2'deoxyuridine) حل (10 ملغ / مل في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [دمس]] إلى زيادة القابلية للذوبان).
- حقن الفئران مع 100 ميكرولتر ايدو (50 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن الملكية الفكرية 24 ساعة السابقة للتضحية.
4. خلايا الحصاد لعلم الخلايا الطرد المركزي (2.5 ساعة، ~ 30 دقيقة اليدين في الوقت المحدد)
- إعداد 3 ملغ / مل كولاجيناز أنا في برنامج تلفزيوني.
- الموت ببطء الماوس عن طريق الخنق ثاني أكسيد الكربون بمعدل تدفق ما لا يزيد عن 3 لتر / دقيقة، وتنفيذ خلع عنق الرحم كإجراء الثانوي.
- تحديد موقع وتر إصلاحها باستخدام الخطوة 2.4 أعلاه، وعزل الأنسجة وتر عن طريق قطع حوالي 2 ملم على جانبي موقع الإصابة مع مقص الصغرى.
- نسيج اللحم المفروم مع مشرط في طبق بتري مع 1 مل من 3 ملغ / مل كولاجيناز، ثم تمرير الخليط من خلال 18 G إبرة عدة مرات لتفريق النسيج. جمع الخليط في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي. هضم الأنسجة وتر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- الأنسجة تدور أسفل (300 x ج لمدة 5 دقائق)، نضح كولاجيناز، resuspend ثم الخلايا / الأنسجة مع الزلال 500 ميكرولتر 3٪ المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
- تعليق خلية مرشح من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون لإزالة الحطام وقطع كبيرة من وتر، وتوضع جانبا في الحاضنة 37 درجة مئوية.
- وضع الأنسجة وتر في أنبوب آخر الطرد المركزي 1.5 مل، وتحديث مع 1 مل من محلول كولاجيناز، pipetting صعودا وهبوطا إلى المزيج.
- احتضان الأنسجة آخر ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- تدور باستمرار الأنسجة وتر هضمها (300 x ج لمدة 5 دقائق)، ثم resuspend في 500 ميكرولتر 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
- تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، مع الجمع بين تعليق معزولة في 4.3.3، ثم عد الخلايا مع عدادة الكريات.
- غسل الخلايا مرة أخرى مع 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني، resuspend ثم إلى 3-6× 10 4/100 ميكرولتر.
- إرفاق قمع الخلايا إلى شريحة موجبة الشحنة وقفل إلى الناقل الشريحة. إدراج الجهاز بأكمله إلى جهاز للطرد المركزي الخلايا وإضافة تعليق الخلية 100 ميكرولتر إلى القمع. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لتفريق الخلايا إلى الشريحة.
5. سيتولوجية مناعية لكشف ايدو (2 ساعة، 45 دقيقة ~ اليدين في الوقت المحدد)
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات حضانة في الظلام للحد من photobleaching من fluorophores من.
- خلايا دائرة بالقلم حاجز مسعور للحد من الحل اللازم لاتخاذ الخطوات التالية، ثم إصلاح فورا مع 150 ميكرولتر 3٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- يغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع 150 ميكرولتر 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
- خلايا Permeabilize مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 20 دقيقة في RT.
- خطوة تكرار غسل كما هو الحال في 5.1.1.
- إعداد EDU رد فعل cocktتزعج وفقا لتعليمات مجموعة لا تزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- إضافة 150 ميكرولتر كوكتيل على كل شريحة، واحتضان 30 دقيقة في RT.
- خطوة تكرار غسل كما هو الحال في 5.1.1.
- احتضان مع 150 ميكرولتر مباين النووية Hoechst33342 المخفف 1: 2000 في برنامج تلفزيوني مدة 30 دقيقة في RT.
- يغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع 150 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 1-2 قطرات مكافحة تتلاشى المتوسطة إلى خلايا المتصاعدة، ثم ببطء أقل ساترة لمنع الفقاعات.
- يسمح للتصاعد المتوسطة لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في RT.
- استخدام طلاء الأظافر واضحة لختم ساترة إلى الشريحة.
- الشرائح صورة في 40X التكبير باستخدام مجهر فلوري مزودة بمرشحات الإثارة / الانبعاثات قادرة على الكشف عن دابي (Hoeschst33342)، وتكساس الأحمر (اليكسا فلور 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إبهام اليد الباسطة لأصابع (إف دي إل) في العضلات، وتقع في ربلة الساق، تعمل لثني أصابع مخلب هند ماوس عبر وتر العضلة القابضة (الموضحة باللون الأزرق في الشكل 1A، ويظهر تشريحيا في الشكل 2A)، الذي يمتد بشكل قريب من myotendinous تقاطع وينهي في السلاميات البعيدة. في هذا النموذج للشفاء العضلة القابضة وتر، ومقطوع وتر إف دي إل وإصلاحه في منتصف القدم، والأقرب إلى التشعب في لأرقام من مخلب هند (السهام الحمراء، الشكل 1A). لمنع تمزق الإصلاح، الذي من شأنه أن يحول دون تحليل تجريبي، يتم قطع وتر (والعضلات المجاورة)، أو الإفراج عنهم، عند تقاطع myotendinous (السهم الأصفر في الشكل 1B، وإطلاق سراح هو مبين في الشكل 1C). بينما هذه الخطوة لا تمثل السيناريو السريري، من المهم جدا لحماية إصلاح عن طريق تقليل الضغط على موقع الإصابة. الشكل 2Dمثال النسيجي للإصلاح المثنية وتر تمزق، مقارنة الإصلاح الناجح هو مبين في الشكل 2C. في الأخير، يعرض النسيج الحبيبي زيادة كبيرة الخلوية بالمقارنة مع وتر لم يصب (الشكل 2B)، وهذه الفئة من السكان الخلايا ويمكن بعد ذلك إجراء المزيد من التحليل عن طريق الطرد المركزي الخلايا على شريحة تليها مناعية الشكل 3 يحدد إجراء التجارب المستخدمة لتقييم الدولة التكاثري من الخلايا التي تم جمعها من الشفاء الأوتار 10 أيام بعد إصلاح عبر ايدو إدراجها في الحمض النووي توليفها حديثا. لذا يظهر EDU وضع العلامات فقط تلك الخلايا التي انتشرت بشكل فعال خلال فترة 24 ساعة التالية نبض ايدو في الفئران الحية، كما رأينا في الشكل (4). والتقييم الكمي للانتشار في النسيج الحبيبي في وتر الشفاء ومن ثم يمكن تحديد بفارق نقطة والعد إعداد الخلايا بأكمله. في هذه الطريقة، والأساس تاييديمكن أن تنشأ التموينية في كل نقطة زمنية، ويمكن تقييم أي تغييرات بسبب التدخلات وراثية أو الدوائية.
الشكل 1 :. الفئران هند باو التشريح والتعرف على المثنية الطويلة للأصابع وتر. وإبهام اليد الباسطة لأصابع (إف دي إل) تنثني الأرقام في كف فأر هند ويمتد على طول الجانب الراحي من مخلب هند (المبينة إف دي إل باللون الأزرق) حيث bifurcates في أرقام (السهام الحمراء) (الشكل 1A). قريب، يعمل وتر إف دي إل من خلال النفق الرصغي (السهم الأسود)، في ربلة الساق، تنتهي عند تقاطع myotendinous (السهم الأصفر) (الشكل 1B). يظهر الافراج عن وتر في تقاطع myotendinous لمنع تمزق في الشكل 1C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وستعرض الصور النسيجية التمثيلية للأون بجروح، شفاء عادي وإصلاح تمزق العضلة القابضة وتر تشريح وتر إف دي إل في مخلب هند الفئران في الشكل 2A: الرقم 2. يمثل مقياس شريط 1 مم. في الأرقام 2B-D، ويضاعف وتر في 8X لمقارنة لم يصب وتر الأنسجة (الشكل 2B) لإصلاح حالها وتمزق (أرقام 2C و 2D، على التوالي). كانت ثابتة كلها عينات مخلب الخلفيتين في الفورمالين محايدة مخزنة، جزءا لا يتجزأ من البارافين، وقطع في 3 ميكرون أقسام، وملطخة الألسيان الأزرق / الهيماتوكسيلين / أورانج G كما هو موضح سابقا (13). ويرد وتر الأصلي باللون الأزرق، ويرد مركب وتر / التحبيب الأنسجة باللون الأخضر، والسهام السوداء تشير الغرز. تمثل الحانات مقياس 200 ميكرون. Pتأجير انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): إجراء التجارب إلى تنفيذ EDU النقر ذلك الكيمياء على الاستعدادات خلية في يوم 10 بعد الجراحة الشفاء الأوتار إف دي إل تم تشريح من الماوس الكفوف الخلفيتين. تم مفروم الأوتار ثم هضمها لمدة ساعتين في كولاجيناز أنا لفصل الخلايا. وقد توترت تعليق خلية لإزالة الأنقاض، و~ 6 × كانت تغزل 10 4 الخلايا في أحادي الطبقة على الشرائح الزجاجية موجبة الشحنة باستخدام جهاز للطرد المركزي الخلايا. وقد حلقت الخلايا مع قلم حاجز مسعور ومن ثم إصلاح فورا مع امتصاص العرق. بعد permeabilization مع تريتون X-100، تم علاج الخلايا مع كشف كوكتيل ايدو، ورد فعل انقر الكيمياء ملزمة اليكسا فلور 594 لايدو يدمج. وقد استخدم هويشت 33342 باعتباره وصمة عار النووية، والخلايا ور البريد تحليلها في 10-40X مع المجهر الفلورسنت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم حصاد تحليل سيتولوجية مناعية للخلايا المسمى EDU-الدراجات خلال الأوتار العضلة القابضة وتر شفاء شفاء إف دي إل من الكفوف الخلفيتين من الفئران 10 أيام بعد الجراحة ويتفاعل مع كولاجيناز للحصول على تعليق خلية: الرقم 4. واستخدمت الطرد المركزي لتفريق هذه الخلايا في أحادي الطبقة على الشرائح، تليها مناعية لصورة EDU التأسيس. الشكل 4A و 4B الشكل والصور التي التقطت في 10X 40X وعلى التوالي من الخلايا التالية تحليل immunocytochemical. وصمة عار النووية هويشت 33342 باللون الأزرق، وتنتشر الخلايا التي أدرجت ايدو مع الأحمر. تمثل الحانات نطاق 50 ميكرون.أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتقدم العملية الجراحية لنموذج الفئران من transection كاملة وإصلاح المثنية لأصابع إبهام اليد وتر في هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك يتجلى تطبيق رواية التركيز السكان خلية صغيرة مع أجهزة الطرد المركزي الخلايا، مما يسمح للتحليل الكمي immunocytochemical البيئة الخلوية أثناء الشفاء المثنية وتر. هذا نموذج للإصلاح المثنية وتر يدل على استجابة الشفاء استنساخه، والتي يمكن استخدامها لتقييم التغيرات في عملية الشفاء باستخدام نماذج بالضربة القاضية أو مع التدخل الدوائي. بعد الجراحة، يبدأ تفاعل التهابي خلال 24 ساعة، حيث يتم تجنيد الخلايا إلى موقع الإصابة والكالس من النسيج الليفي يبدأ بالتشكل. يتبع المرحلة التكاثري في حوالي اليوم الرابع، التي تنطوي على زيادة كبيرة الخلوية وترسب وفيرة من المصفوفة خارج الخلية غير منظمة في موقع إصلاح، مما يؤدي إلى تشكيل التصاق بين 14-21 يوما. الأنسجة إعادة كونتيnues خلال يوم 35، حيث يتم استعادة استمرارية الوقت والتنظيم في وتر العضلة القابضة، ويتم تخفيض الخلوية 18.
حاليا، هناك العديد من نماذج الفئران من إصلاح وتر العضلة القابضة بالإضافة إلى تلك التي يتم عرضها هنا. Tsubone وآخرون، وصفت نموذجا في المختبر من المثنية وتر الشفاء 19. في حين أن هذا النموذج من تقييم التغيرات في التعبير الجيني مع مرور الوقت، فإنه لا يمكن حساب لتجنيد خلايا خارجي أو تغييرات في التهابات الوسط خلوى / الذي يحدث في الجسم الحي. في الجسم الحي، وقد تم تطوير نموذجين من transection الجزئي باستخدام الجراحي أو استئصالية عيوب 20،21. وفي الآونة الأخيرة، وونغ وآخرون، يتميز نموذج المنطقة الثانية من اصابة في العضلة القابضة وتر في نموذج الفئران 22. هذا تطور مهم، لأنها تتيح للمساهمة الخلايا المشتقة غمد الزليلي في عملية الشفاء إلى تعريف. ومع ذلك، لا للقياس الكمي وقد وصفت التغيرات في وظائف مزلق باستخدام هذا النموذج. كل نموذج له فوائد والقيود التي يجب أخذها بعين الاعتبار، بما في ذلك سهولة التقنية وأهميتها السريرية وعلم التشريح الخاصة بها. والقيد الرئيسي للنموذج الموصوفة هنا هو أن وتر الشفاء قد تمزق قبل التقييم، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال لمزيد من التحليل. حصاد خلايا كافية يرصد غير مجد في ظل هذه الظروف، وأي تحليل النسيجية غير قابل للحياة، ووتر تمزق لا يتبع عملية الشفاء القياسية المذكورة أعلاه. وبالتالي الإفراج عن وتر إف دي إل قريب لتقليل الضغط على وتر الشفاء هو خطوة حاسمة لمنع، على الرغم من أنها ليست ذات الصلة سريريا. إجراء عملية جراحية من طرف واحد أيضا يقلل من معدل تمزق. الحد الآخر هو عدم القدرة على تعقب مساهمة من خلايا غمد شبه الوترية، وغمد الزليلي لا تحيط جزء من إف دي إل وتر الذي أصيب في هذا النموذج.
jove_content "> وظيفة هامة من هذا المثنية نموذج إصلاح وتر هو أنه يتيح تقييم الخلايا في الموقع الشفاء. المناعي / المناعية (IHC) هي تقنية البيولوجية المشتركة التي يمكن استخدامها لوصف هذه الخلايا، في حين IHC تحتل مكانة فريدة لتحديد المعلومات المكانية، هو إلى حد كبير طريقة النوعي التغيرات في الأنسجة أو تكوين الخلايا في جميع أنحاء عمق الأنسجة يمكن تفويتها، وتقدير حجم السكان أمر صعب. تدفق يمثل الخلوي النهج الأمثل لتحديد وقياس ويحتمل أن عزل الخلايا السكان أثناء الشفاء. ومع ذلك، منخفضة جدا أرقام زنزانة انفرادية وهضم أنسجة الشفاء وتر من هذه العوائد نموذج لتحليل تدفق cytometric (1-2 × 10 5 في المتوسط من كل فأر)، وتثبيت / permeabilization خطوات للكشف عن علامات الخلايا يقلل هذا العدد أكثر من ذلك. عن طريق الخلايا الطرد المركزي لتركيز الخلايا المعزولة، تليها immunocytocheاللغز، يوفر وسيلة لتميز هؤلاء السكان الخلايا الصغيرة. وهناك ميزة كبيرة لهذا الأسلوب هو أنه ليست هناك حاجة لعينات تجمع معا للحصول على ما يكفي من الخلايا. وبالتالي يمثل كل فأر عينة الفردية للتحليل. وهو عامل مهم في توليد هذه الاستعدادات الخلية هو الحفاظ على الاتساق في الأنسجة التي تحصد للتحليل. العضلات المحيطة ورباط أن تنضم إلى النسيج الحبيبي ويجب تشريح بعناية بعيدا. لأن هذا الأسلوب ينطوي على معالجة الحد الأدنى من الخلايا قبل التثبيت على الشرائح، فإنه يحتفظ غالبية الخلايا المعزولة لمزيد من التحليل. وبهذه الطريقة، ما يقرب من السكان من الخلايا التي تشكل الأنسجة التصاق في موقع إصلاح يمكن تقييمها كميا عن طريق مناعية. في هذه الدراسة، ويستخدم ايدو التأسيس من قبل الخلايا المتكاثرة للتدليل على تطبيق هذه التقنية الخلايا، ومع ذلك، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لأكثر تعقيدا ومتعمقة توصيف سو السكان الخلية غير متجانسة المشاركة في الشفاء المثنية وتر. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية قد يؤدي إلى تعمق أكثر في توصيف السكان الخلية تشارك في الشفاء وتر، كما أنه يتيح تحديد شارك في توطين علامات الخلوية في الخلايا المرتبطة النسيج الحبيبي في وتر الشفاء.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل الجمعية الأمريكية لجراحة جائزة الطيار اليد والمعاهد الوطنية للصحة / NIAMS 1K01AR068386-01 (لAEL) وNIAMS / المعاهد الوطنية للصحة P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
