Abstract
건강의 ImageJ에 국립 연구소는 강력하고 자유롭게 사용할 이미지 처리 소프트웨어 제품군입니다. ImageJ에 다양한 생물학적 입자를 계산하기 위해 효과적으로 사용할 수있는 포괄적 인 입자 분석 알고리즘을 보유하고 있습니다. 세포 샘플들의 다수를 카운트하면 혈구 시간 관련하여 병목 현상을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 ImageJ에 플러그인 셀 카운터와 마이그레이션 / 침공 분석에서 막을 계산 정확하지만, 손목 통증을 일으키는 매우 노동 집약적 주관적인, 그리고 악명입니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 자동 혈구 (또는 알려진 볼륨) 및 마이그레이션 / 침략 세포 계수의 유일한 작업 ImageJ에 내 두 개의 플러그인을 개발했다. 두 플러그인 최소 배경 고품질 현미경 사진을 획득 할 수있는 능력에 의존한다. 그들은 사용하기 쉽고 카운트 교정에 도움 내장 된 분석 도구와 큰 샘플 크기의 빠른 계산과 분석에 최적화되어 있습니다. 핵심 원리를 결합하여자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 분석 계산 셀 카운터 (S)이 크게 이동 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다.
Introduction
시험 관내 세포 카운트에서 조직 배양 실험의 넓은 범위의 중요한 기본 기술이다. 정확하게 배양 세포의 수를 결정하는 실험 재현성 표준화 1,2- 필수적이다. 세포는 혈구 계산을 사용뿐만 아니라 자동화 된 방법의 다양한 고유의 장점과 단점 3,4,5- 각을 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 세포 계수에 대한 자동화 된 방법의 대부분은 두 개의 클래스, 콜터 원리를 사용하거나 유동 세포 계측법이 그 중 하나에 속한다. 콜터 카운터는 세포 수와 크기를 결정하기 위해 셀의 전기 저항을 이용한다. 이들은 유동 세포 계측기보다 빠르고 정확하고 저렴하다. 그러나, 이들은 거의 수동 계산 3 비교 인해 상당한 비용 만 세포 카운팅에 사용되지 않는다. 한편, 세포 계측기 흐름 비싸다 있지만 휴대 계산, 셀 형상, 명세서의 분석과 같은 많은 응용 분야를 가지고ructure 측정 내부 셀은 4,5 마커. 이 두 원칙 중 하나를 사용 기계는 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 자동화 된 방법은 수동 계산에 필요한 시간의 일부와 함께하지만 비싼 기계 (6)을 사용하는 동안 수동 계산은 저렴하지만 시간과 바이어스의 적용을받습니다.
다른 일반적인 세포 배양 과정은 시험 관내 세포 운동성 분석, 즉, 세포 이동 및 침입 7이다. 마이그레이션 및 침략 분석은 일반적으로 화학 주성 응답에 대한 응답으로 세포 운동성 및 침입을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, 이들은 널리 여러 세포 유형 7-11 배아의 발달, 분화, 염증성 반응 및 전이를 연구하기 위해 사용된다. 마이그레이션 분석의 다공질 막을 통해 이전 또는 침입 한 세포는 두 가지 방법으로 정량화 될 수있다. 첫째, 형광 염료로 염색 세포를 해리하여 이리저리형광 판독기 (12)를 사용하여 막 및 정량화 해요. 정량이 방법의 제한은 기록 막의 유지 될 수 없으며 추가 분석 13 가능성이 없다는 것이다. 마이그레이션에 대한 두 번째 정량 방법은 / 고정 및 크리스탈 바이올렛, 톨루이딘 블루 염색 또는 헤 마톡 실린과 같은 세포 학적 염료와 더 일반적으로 형광 염료, 염색되는 세포를 침공된다 그 다음 세포는 수동으로 매우 시간이 걸리는 작업 12,13 이들 막의 반전 현미경 이미지를 사용하여 정량화된다.
수동 세포 계수의 단점을 극복하기 위해, 세포 농도 및 마이그레이션 분석을위한 두 신뢰성 있고 정확한 자동 세포 계수기가 개발되었다. 이러한 자동 세포 계수기 알고리즘 오라클 자바 컴퓨터 언어를 사용하여 플러그인으로 ImageJ에 대해 개발되었다. ImageJ에는 난방 국립 연구소에서 개발 한 공공 및 널리 사용되는 이미지 처리 도구입니다l 번째 (NIH) 14, 15; 따라서, ImageJ에 이러한 플러그인을 작성하는 것은 생물학적 지역 사회에 쉽게 통합을 용이하게합니다.
세포 계수의 자동화는 수동 계산에 비해 높은 처리량과 재현성을 보장합니다. 다른 가능한 소프트웨어 및 플러그인은 이미지 분석 5,16,17, 세포 농도 계산기 플러그인을 통해 세포 농도를 계산하기 위해 사용될 수 있지만 고속이며 또한 세포 치료의 희석 처리 할 수있다. 또한,이 두 카운터에서 모든 결과 및 계산을 저장하고 내보낼 수 있습니다. 이 논문에서 설명 된 두 개의 플러그인 해부 범위의 사용을 통해 생균 이미징 마이그레이션 분석 멤브레인 큰 시야 (전체 막 캡처) 이미징 위상차 현미경의 사용을 위해 최적화된다. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins : 플러그인은에서 설치 지침을 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 복합 현미경과 카메라 설정 (세포 농도 계산기)
- 빛 조절 노브 전체에 전구의 밝기를 높이 4 배 대물 렌즈로 전환하고, 위상차 필터가 선택되어 있는지 확인.
참고 : 어두운 배경과 조직 문화에 대한 모든 역 위상차 현미경, 예를 들어, PHP는 위상차, 표준 현미경 카메라 절차에 따라 사용할 수 있습니다. - 현미경의 소프트웨어 내에서 기본값으로 이미지 캡쳐 설정을 설정합니다.
참고 : 이러한 설정의 위치를 찾기 위해 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오.- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
참고 : 소프트웨어에 따라, '밝기'와 '대비'는 0 %의 값 대신 100 %로 기본 수 있습니다. - 설정 이미지는 검은 색과 흰색이 가장 높은 해상도 availabl를 사용하여 캡처 할전자 (1,600 X 1,200 픽셀 (픽셀) 이상).
참고 : 흑백 설정을 사용할 수없는 경우 0 %의 '포화'충분하다.
- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
- 현미경 스테이지로 표준 혈구를 배치하고 (도 1a)에 도시 된 바와 같이 이미지를 캡처; 이것은 '볼륨 교정 이미지'입니다. 필요에 따라 노출 타이밍을 조정합니다.
2. 이미지 볼륨 교정
- 오픈 ImageJ에와 플러그인 메뉴에서 셀 농도 계산기 (CCC) 플러그인, 예를 들어, 플러그인> 분석기> '셀 농도 계산기'를 시작합니다.
- 오른쪽 '이미지 볼륨 교정'패널이 보이지 않으면, 그것을 보여주기 위해 '교정'을 클릭합니다.
- ImageJ에에서 '가져 오기 이미지 차원'버튼을 단계 1.3 ( '파일'> '열기')에서와 CCC 클릭의 '볼륨 교정 이미지'를 엽니 다.
참고 :이 두 이미지를 입력합니다 너비와자동 픽셀 이미지 해상도와 높이 텍스트 상자. - ImageJ에에서 선택 도구에 '직선 도구'다음 선택하고 클릭하고 커서를 드래그하여 (그림 1B)에서 설명 -square 혈구 차 (P)의 전체 길이에 걸쳐 직선을 그립니다.
- 직선 측정을 포함하는 결과 창을 표시 할 수있는 'M'키를 누르십시오. CCC의 'P-평방 길이'텍스트 상자 (그림 1B)로 길이 열에서 값을 입력합니다.
- 출력에 '이미지 볼륨을 계산'버튼을 이미지 볼륨 텍스트 상자에 이미지 볼륨을 클릭합니다. 이미지 볼륨이 이미 알려진 경우 선택적으로, 상기 이미지 량 입력란에 내셔널 리그 볼륨 입력.
- '저장'버튼을 클릭합니다.
참고 : 플러그인 지금 교정.
3. 카메라의 노출 보정
- 에 대한 다음과 같은 세포 수확혈구의 챔버에 혈구, 부하 세포의 10 μL를 통해 계산하고 현미경 스테이지에 배치합니다.
- 혈구의 배경 라인 사라지게되도록 단계 120에서 동일한 설정을 사용하여, 노광 시간을 조정한다.
- 셀의 내부는 중앙 교차 셀의 부분이 아닌 극 내의 포커스를 나타내는 세포막보다 어둡게되도록 초점을 조정한다.
- 또한, 세포가 과다하지 않도록 노출을 조정하고 (도 1C)에 도시 된 것과 유사.
참고 : 약간 보이는 혈구 라인이 허용됩니다. 정확성과 재현성을 유지하기 위해 이러한 설정을 저장하거나 기록하는 것이 좋습니다.
4. 이미지 인식
- 각각의 세포 샘플의 경우, 혈구의 양 챔버에 부하 10 μL 통계적 추론 능력이 증가합니다. 현미경 단계에 혈구를 배치이미징.
주 : 각 이미지의 해상도와 배율이 '볼륨 교정 이미지'와 동일해야합니다. 플러그인은 선택된 폴더의 모든 이미지를 계산; 유지 이미지는 같은 폴더에 함께 계산한다.- 파일 이름의 자동 증가 기능을 사용할 수있는 경우, 전원을 켜 각각의 이미지가 처리량을 증가 캡처 후 표시되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
참고 : 수동으로 저장하고 크게 과정을 느리게 각 이미지를 폐쇄. 자동 증가 기능의 가용성에 대한 자세한 내용은 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오. - 이상 (5-10)의 정확도를 높이기 위해 추천되었지만 혈구의 중앙 영역의 적어도 세 개의 비 중첩 이미지를 캡처.
참고 : 세포가 두 위치에서 밀도가 증가하는 경향 상단과 챔버의 하부 영역 모두를 피하십시오. 각 실 화상에 대해 동일한 번호를 가라. 이 계산하는 동안 플러그인의 적절한 기능에 필요합니다.
5. 이미지 계수 및 희석
- CCC에서 '셀 카운트'를 클릭하고 디렉터리를 선택 대화 상자를 관찰합니다. 폴더를 선택 계산합니다.
- 폴더를 선택한 후 시료 번호 입력 창을 관찰한다. 챔버 당 촬영 한 이미지, 즉, 4.1.2의 번호를 입력하고 '확인'을 클릭합니다. 플러그인은 이제 알파벳 순서에서 선택한 폴더의 모든 JPG, TIFF 및 PNG 이미지를 계산합니다.
참고 : '샘플 뷰어'버튼을 클릭하면 계산 샘플에 대한 정보를 표시하는 샘플 뷰어 창을 가져올 것이다. 샘플 농도는 챔버 당 찍은 모든 이미지의 평균 농도이다. 단위없는 시료 농도는 약물 또는 소분자 치료의 추가로,이리스트에 추가 될 수있다.- 농도가 동일한 샘플 (섹션 4)의 카운트 내에서 상당히 다를 경우 세포 샘플을 재검 표.
주 : 모든 희석을 계산하기 위해 t그가 계산-샘플을, CCC는 자동으로 화학식 C 1 V 1 = C 2 V 2를 사용합니다.
- 농도가 동일한 샘플 (섹션 4)의 카운트 내에서 상당히 다를 경우 세포 샘플을 재검 표.
- 추가로 96 웰 플레이트 + 1의 30 우물에 파종의 200 μL 당 15,000 세포 시나리오를 사용하여
- 'μL'에 인접 콤보 상자 단위를 변경, 15,000에 C2 레이블의 오른쪽과 200 농도 볼륨 텍스트 상자에 텍스트 상자를 설정합니다.
참고 : 플러그인이 궁극적으로 세포 / mL의 농도를 계산합니다. - 반드시 볼륨 콤보 박스 V2 선택한 (최종 부피)을 확인하고 오른쪽 텍스트 박스의 볼륨 단위 콤보 박스 'μL'를 선택하면 (6200) (200 μL의 × (30 + 1))를 입력한다.
- 'μL'에 인접 콤보 상자 단위를 변경, 15,000에 C2 레이블의 오른쪽과 200 농도 볼륨 텍스트 상자에 텍스트 상자를 설정합니다.
- 왼쪽 아래 목록 상자에 현재 입력 희석을 추가하는 '계산 희석'을 클릭합니다.
주 : 각 첨가 희석, 각 샘플에 대해 해결 될 것이고, 우측의 트리도 표시. 각 항목을 두 번 클릭 확장합니다. - 클릭 t그는 '샘플 뷰어'버튼 아래에 '저장'버튼을 모든 샘플 데이터와 희석을 파일에 쓸 수 있습니다.
- 참고 :이 데이터는 '로드'를 클릭하고 저장된 파일을 선택하여 언제든지 복구 할 수 있습니다.
6. 마이그레이션 및 침략 (카운터)
- 표준 보이든 챔버 방법 7-9을 사용하여 마이그레이션 및 침략 분석을 수행합니다.
- 세포 마이그레이션 한 후 / 침략주의 깊게 반전 부드럽게 눌러 삽입 내에서 용지를 제거합니다. 심지 멀리 초과 매체는 종이 타월에 가장자리를 터치하여 멤브레인의 하단에 부착.
참고 :이 부착 된 셀을 제거 할 수 있습니다, 수건에 막 자체를 만지지 마십시오. - 수정 및 다른 솔루션의 ~ 포함하는 각 행과 설정 24 웰 플레이트에 500 μl를보고 7-9으로 세포를 염색, 예를 들어, 정착액, 얼룩 하나, 얼룩 2를 두 번 증류수 (DDH 2 O). 1X PBS의 t와 제 2 플레이트를 채우기O를 절단하기 전에의 삽입을 배치합니다.
- 반전에 의해 세포를 멀리 보라고 전에 물을 배수 DDH 2 O 가득 우물로 배치하여 삽입을 씻고 DDH 2 O와 삽입물을 입력합니다.
- 멤브레인이 손상되지 않도록 막 돌보는의 상단에서 해제 마이그레이션 / 취소 침입 세포를 제거하기 위해 깨끗한면 주걱을 사용합니다. 멤브레인의 가장자리 주위에 철저해야합니다.
- 깨끗한 유리 슬라이드에 막 (바닥면을 위로) 전송 신중하게 면도칼이나 메스를 사용하여 막을 잘라.
- 아래 멤브레인의 상단에 장착 용액의 작은 방울을 추가하고 얇은 커버 슬립으로 다룹니다.
참고 : 계산의 정확성을 유지하기 위해 설치 솔루션 내에서 거품을 트래핑하지 마십시오.
7. 범위 및 카메라 설정을 해부
- 현미경의 광원과 카메라를 켭니다.
참고 : 자세한 지침은 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오. - 재치현미경의 소프트웨어 설정 이미지 캡쳐 설정을 힌은 기본값입니다.
주 : 평균화 기능이 존재하는 경우, 4 인 값이 권장된다. 이는 평균 및 영상 획득 시간의 정도 사이 좋은 타협이다. 마찬가지로, 선명의 작은 정도는 이미지 충실도를 증가시킬 수있다.- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
참고 : 소프트웨어에 따라, '밝기'와 '대비'는 0 %의 값 대신 100 %로 기본 수 있습니다. - 최대 설정으로 설정 디스플레이 (실시간) 캡처 해상도 (1,600 X 1,200 픽셀 및 2592 X 1944 픽셀, 각각).
주 : 디스플레이 해상도 리프레시 속도가 너무 느린 경우 필요에 따라 조정될 수있다. 낮은 해상도는 더 어려워 정확하게 초점을 맞출 수 있도록하지만, 재생 빈도를 증가시킬 것이다.
- '밝기', '대비', 그리고 100 % '포화'와 '감마'및 1.0 '이득'을 설정합니다.
- 해부 범위 스테이지를 들어, 백색 고체를 backgro에 사용싶게; 검은 색 또는 유리 배경이 부족합니다.
- 우측으로 두 개의가요 LED 조명으로부터 바람직하게는, 상기 스테이지의 광원을 사용하여 스테이지의 왼쪽.
주 : 광원 부정적인 후속 계산의 정확성에 영향을 미칠 수있는 마이그레이션 분석 막 내의 기공을 조명 아래 단계를했다. - 무대 위에 완성 된 마이그레이션 분석 막 슬라이드를 놓습니다. 단일 막의 가장자리 단지 카메라의 시야 내에 있도록 소프트웨어로 표시되는 실시간 영상을 보면, 줌 조정 노브로 배율을 조정한다.
참고 : 유리 접시에 슬라이드를 배치는 솟다 흰색 배경 단계는 쉽게 이미징을위한 슬라이드를 기동 할 수 있습니다. - 가능한 한 근접도 2a에 도시 된 이상적인 이미지를 재현하는 광원 위치 (7.6.1) 및 노출 시간을 조정한다. 밝기에 따라 5-60 MS의 노출 시간은 충분합니다.
노트:목표는 가시 세포의 손실로 이어지는 가능한 적은 배경 색상 즉 이미지 충실도를 저하시키지 않고 균일 한 조명 막 과다에 의한 이미지를 생성하는 것이다.- 슬라이드에 낮은 각도로 왼쪽과 오른쪽 광원을 배치합니다. 이 배경 얼룩과 색수차를 제거하는 데 도움이됩니다. 다른 직접 반대 각각의 광원을 유지하십시오.
참고 : 위치에 각각의 광원을 조종하는 동안, 다른 전원을 끄십시오. 이것은 그 자체보다 쉽고 정확하게 막 위에 조명 영역의 중심을 돕는다.
- 슬라이드에 낮은 각도로 왼쪽과 오른쪽 광원을 배치합니다. 이 배경 얼룩과 색수차를 제거하는 데 도움이됩니다. 다른 직접 반대 각각의 광원을 유지하십시오.
- 슬라이드 및 화이트 밸런스 현미경 소프트웨어에서 하나의 버튼 클릭을 사용하여 이미지를 제거합니다.
주 : 현미경 지금 교정. 향후 사용을 위해 가능한 한 많은 설정을 저장하고 광원의 위치와 강도의 주를 가지고.
8. 이미지 인식 및 Flatfield () 현재
- 소프트웨어 내에서 설정캡처 폴더 위치 및 캡처 막 당 하나의 이미지입니다. 의 일반적인 템플릿 다음 이미지 이름 : 이름 - 등등 001.tif 및 - 예를 들어, ###, 제어 - 001.tif, 제어 - 002.tif, 시험 약을.
주 : 최상의 이미지 검색 결과를 들어, JPEG 등의 손실 형식을 통해 티파니와 같은 이미지 파일 형식을 저장합니다.
참고 : 이미지가 여전히 계산됩니다 일반 템플릿을 다음하지하지만 자동 그룹화 및 평면 수비에 적용 대상이되지 않는다.- Flatfield () 현재 수정이 필요한 경우, 각 슬라이드의 빈 영역을 발견하고 명명 규칙 다음 빈 이미지를 촬영 : 이름 - 빈.
주 : 빈 더 막을 포함하지 배경 조명을 나타내는 슬라이드의 영역입니다. - 즉시 촬상 전에 커버 슬립 위에 압력을인가함으로써 각각의 막 평탄화 가능한 많은 포획 된 기포를 제거한다.
- Flatfield () 현재 수정이 필요한 경우, 각 슬라이드의 빈 영역을 발견하고 명명 규칙 다음 빈 이미지를 촬영 : 이름 - 빈.
- ImageJ에에서 플러그인으로 이동하여 TC 플러그인을 엽니 다; 예를 들어, 플러그인>> & # 분석39; 트랜스 웰 카운터 '.
- TC 내에서 'Flatfield () 현재'버튼을 클릭 디렉토리를 선택 대화 상자를 관찰합니다. 막 이미지가 저장된 폴더를 선택합니다.
참고 : 위의 일반 템플릿으로 저장 한 이미지 만 자동으로 수정 및 선택한 폴더 내에 Flatfield () 현재라는 새 폴더에 저장 Flatfield () 현재됩니다. Flatfield () 현재 보정 된 이미지의 예는도 2b를 참조하십시오.
9. 구성 설정
- 마이그레이션 분석 막 ImageJ에있는 이미지 ( '파일'> '열기')를 선택 이미지> 조정> '컬러 임계 값 ...'을 엽니 다. 이미지의 필터링됩니다 어떤 색상을 조정하는 컬러 임계 값 창을 준수하십시오.
- 창 하단의 'RGB'(적색, 녹색, 청색)으로 설정 임계 화 방법 'Shanbhag'에, '화이트'에 대한 임계 값 색상, 색 공간에서; 선택한 경우 선택을 취소 어두운 배경입니다.
- 상단 조정클릭하고 0 ~ 255의 범위에 마커와 하단의 슬라이더를 드래그하여 슬라이더 (255에서 바닥 슬라이더를 떠나). 이미지가 완전히 흰색 있는지 확인합니다.
- 만 핵이 보일 때까지 녹색과 빨간색 위쪽 슬라이더를 조정합니다.
참고 : 사용되는 세포 얼룩에 따라 완전히 달라집니다 선택한 설정. 도 2c를 참조하십시오. - 위원회 플러그인에서 입력 관련 환경 설정 'RGB 임계 값'텍스트 상자에 RGB 상단 슬라이더의 값. '추가 / 수정'버튼을 클릭하고 설정을 덮어 씁니다.
- 1의 크기 범위 하한과 상한 값을 남겨 - 무한합니다.
- 환경 설정 패널 내 하드 드라이브에 설정을 작성하는 '저장'을 클릭합니다.
10. 계수 이미지 및 교정
- 위원회 플러그인 (8.2)을 열고 '폴더를 계산'을 클릭하고 디렉터리를 선택 대화 상자를 관찰합니다. 폴더를 선택하는 것은 계산에이 끝날 때까지 차 기다립니다.
- 각 계산 샘플은 자동 기본 테이블에 추가된다. 키 열은 '백작', '품질'및 '교정?'입니다.
주 : 비 - 보정 카운트 열 '지역 범위'표시 영역 내의 막 당 입자의 수이다.
참고 : 품질은 약 -0.8 ~ 1.7의 범위; Q ≥ 0.5 허용됩니다.- 에 확인 표시를 준수 '보정?' 이미지가 교정을 받았습니다 열 경우 이상적인 측정과의 유사성을 기반으로.
참고 : 품질 및 교정 모두 현재 설정이 가능 부족한 것을 제안 할 수 있습니다. 적절한 '색상 임계 화'와 '크기 범위'후 선택되었습니다 및 교정은 여전히 원래의 검사를 제안하고 이미지가 유효한 수의 최종 결정해야한다 계산됩니다.
- 에 확인 표시를 준수 '보정?' 이미지가 교정을 받았습니다 열 경우 이상적인 측정과의 유사성을 기반으로.
- 교정에 대한 신고 됨 테이블의 모든 샘플을 선택합니다.
- t에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭테이블을 선택 재계 그가> '크기를 제안'. 이 제안 된 최소 입자 영역으로 이미지를 재 계산됩니다.
- 다시 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '보기 플롯'를 선택합니다. 입자 영역의 주파수 분산 플롯을 관찰한다. 이상적인 이미지, 즉 긴 마우스 오른쪽 꼬리 정규 분포, 종 곡선을 닮은 그래프해야합니다. 도 3b를 참조하십시오.
- 샘플, 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 선택하고 재계> '수동 설정'을 선택하여 필요한 경우, 낮은 크기 범위를 조정합니다. 수동 설정 대화 상자를 관찰한다. 원하는 설정을 입력하고 새로운 설정으로 이미지를 재 계산하는 카운트를 클릭합니다.
- 수동으로 수를 조정 오른쪽 테이블을 클릭하면, 샘플을 선택하고 '카운트 열기 이미지'를 선택합니다. 플러그인에 의해 계산 각각의 입자를 나타내는 빨간색 마커 원본 이미지를 관찰한다.
참고 : 재계는> 방법을 잘 확인하는 것이 유용 할 수있는 '쇼 이진 이미지를 계산'전ndividual 세포 컬러 임계 값에 의해 해결되고있다.- 수를 추가하려면 'Ctrl 키를'좌 클릭을 개최합니다. 샘플 총 수에 추가됩니다 커서 위치에 마커를 관찰한다. 마커를 제거하려면 이미지를 마우스 오른쪽 클릭합니다. 플러그인은 커서에 가장 가까운 마커를 제거합니다.
- 마커의 그룹을 제거하기 위해, ROI (region of interest)를 선택 ImageJ에있는 선택 도구를 사용한다. 'Ctrl'키를 누른 상태에서 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 내부의 모든 마커가 제거됩니다. '백작'열에서 세포 수를 관찰한다.
11. 저장 / 결과 열기 및 CSV로 내보내기
- > '저장 결과'TC에서 메뉴 표시 줄로 이동하고 '파일'을 클릭합니다. 저장 결과 대화 상자를 관찰한다. 이름과 대상을 선택하고 '저장'을 클릭합니다.
- '결과 열기'가 기본 테이블에 표시되는 모든 데이터를 포함하는 파일을로드 includin에> '파일을'사용g 줄거리.
참고 : 결과 파일은 이미지에 저장된 디렉토리를 저장하는 원래의 이미지가 실패합니다 기능 '카운트 열기 이미지', '열기 원본 이미지'등을 저장 한 후 이동합니다.. - 이미지 디렉토리를 다시 샘플을 선택하려면 오른쪽 테이블을 클릭하고 '이미지 디렉토리 재설정'을 선택합니다. 디렉토리를 선택 대화 상자를 관찰한다. 새 폴더를 선택하고 이미지가 존재하는 경우, 디렉토리가 재설정됩니다. 결과 파일을 다시 저장합니다.
- '결과 열기'가 기본 테이블에 표시되는 모든 데이터를 포함하는 파일을로드 includin에> '파일을'사용g 줄거리.
- 메뉴 바에서, 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 파일을 저장하려면 '.csv로 내보내기' '파일'>로 이동합니다. 이는, 평균 통계 그룹으로 구성 샘플 카운트 및 평균의 표준 오차를 가진 파일을 생성한다; 레이아웃은 일반적인 그래프 프로그램의 빠른 그래프를 위해 설계되었습니다.
참고 : 통계 그룹은 TC 내에서 생성 된 그룹을 기반으로합니다.- 샘플은 일반적으로 명명 템플릿을 따른다면, GR로 샘플을 선택ouped 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '자동 그룹화'를 선택합니다. 이는 동일한 그룹에 동일한 '이름'으로 샘플을 추가한다. 두 컨트롤이 '치료'에 그룹 '제어'및 치료에 추가 할 것 : 1, 제어 - - 2, 치료 - - 1, 치료 2 예 컨트롤을 사용하여.
- 그룹 이름을 두 번 클릭하여 그룹에 수동으로 샘플의 '그룹'셀 입력을 샘플을 추가합니다. 선택 샘플은 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '그룹에 추가',이 그룹에 추가합니다.
- 파일 이름의 자동 증가 기능을 사용할 수있는 경우, 전원을 켜 각각의 이미지가 처리량을 증가 캡처 후 표시되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
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Representative Results
세포 농도 계산기
그림 1은 CCC의 교정 및 가산 이미지 수집의 전체 프로세스를 제공합니다. 도 1a와 1b는 픽셀 P-평방 길이의 P-광장 교정 이미지와 계산을 묘사한다. CCC는 식을 이용하여 소정의 부피로 세포 농도를 결정
혈구의 P-광장은 100 거리 nL의 볼륨 (1 mm × 1 mm X 0.1 mm) 및, 전체 이미지 볼륨이 mm로 픽셀을 변환 한 후이 상수 계산 될 수있다 주어진 있습니다. 도 1C에 초점 세포 특성 상 조명없이 배경 혈구 눈금 표시와 이상적인 가산 이미지입니다. 마지막으로, Figur의 산포도전자 1D는 HTR8, ES-2, Swan71 등 다양한 실험과 세포 유형 점령 57 이미지에서 세포의 자동화 된 수에 비해 높은 상관 관계, 설명서를 보여줍니다. 참고로, 농도의 상한 범위는 ~ 5.6 × 10 6 세포 / ㎖의 ~ 2.3 × 103 세포 / ㎖ (이미지 당 ≈ 5 세포)의 낮은 끝이었다. 이 계수는 이미지 당 10-15 세포 미만인 경우, 샘플이 통계적으로 전력을 증가시키기 위해 작은 부피에 현탁되어야한다고 제안한다.
마이그레이션 분석 카운터에 대한 수집 및 이미지의 처리
마이그레이션 분석 막의 수백 인간 영양막 세포주 HTR8, Swan71 또는 난소 암 세포주 ES-2 시딩 모두 많은 실험을 통해 영상화 하였다. 이러한 이미지의 여러 밝기, 선명도와 staine의 색상에 따라 우수한 품질에 매우 가난에서 범주의 범위를 표현하기 위해 선택되었다D 세포 및 배경 염색과 원치 않는 입자 (노이즈)의 정도. 이 이미지를 사용하여 기본 RGB 임계 값 색상 설정 (≈ 150, 120, 0) (그림 2C) 결정하고, 알고리즘의 모든 후속 개발의 기준으로 사용된다. 목표 즉 총 색 비율로 핵 색을 극대화 하였다 컬러 픽셀의 대부분은 세포 핵 내에 있어야한다. 도 2a에 상판 이상적인 이미지 밝기 세포 핵 선명도, 색상 무시할 배경 잡음을 나타낸다. 화상의 밝기가 흑백 이진 화상을 생성하는 셀과 배경 간의 훌륭한 충분한 콘트라스트가 확인하는 것이 중요하다.
이 차이가 충족되지 않으면, 크거나 예기치 않은 영역은 입자 기능 분석 ImageJ에 의해 계산 될 수있다; 최선의 상황은 완전히 흰색 배경이다. 반대, 인터넷의 하부 패널gure 2a는 극단적 인 배경 염색과 거의 구별 할 수있는 세포를 가지고있다. 염색이 정도 막을 가능성이 높습니다 마이그레이션 분석 카운터에서 신뢰할 수없는 결과를 생성합니다.
일부 예에서, 최적의 수준으로 휘도를 증가 시키면 이미지의 과도한 노출에 의해 화상 정확도에 영향을 미칠 수있다. 마찬가지로, 높은 노출이나 밝기가 점진적 또는 불규칙한 빛과 어두운 영역으로 전신 색채 효과를 생성 할 수있다. Flatfield () 현재 보정,이 효과는 최소화되거나도 2B (상부 대 하부 패널)에 나타낸 바와 같이 완전히 제거 할 수있다. 또한, Flatfield () 현재 보정 여러 막 이미지의 밝기를 균일하게 할 수있는 좋은 방법입니다.
교정 및 마이그레이션 분석 카운터의 검증
미국을 돕기 위해ER 마이그레이션 분석 막의 이미지를 정확히 계산에 필요한 기준을 충족하는 경우에 더 나은 결정 두 한정자 설계되었다라는 이미지 품질 (Q)을 보정 권고 (CR). 중요한 것은, 두 규정은, 이름 CR에서 알 수 있듯이, 오히려 각 이미지의 countability의 절대 심사 위원보다 가이드로만 추천 행위입니다. 두 Q와 CR은 입자 영역 (10.3.2)의 주파수 산포도의 측정을 기반으로합니다. 단순화를 위해, 메트릭은 주파수 플롯을 구성하는 곡선의 다양한 형태로 간주 될 수있다. 적절한 Q (≥0.5)의 원하는 메트릭은 셀 크기의 관찰 대략 정규 분포에 의해 결정 하였다. 일반적으로, 서로 해석 할 수없는있는 세포, 아니면 그냥 특히 대형 스테인드 오버, 오른쪽 꼬리 정규 분포 (그림 3B)에 skewedness을 이동. 이와 같이, 전형적인 이미지 보정 이상적인 메트릭이다. 와배경 잡음의 추가는,이 통상 1-5 화소 영역 범위 (도 3a)의 입자가 다수로 이끈다. 플롯 통계를 계산하기 위해, 데이터는 박사 마이클 토마스 플래너의 Java 과학 도서관 (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga에 의해 생성 다항식도 다른의 열 Savitzky - 골 레이 평활화 곡선 장착되어 있습니다 /자바/). 기본적으로,이 각 극한치의 대략적인 지역의 여러 지점을 만듭니다. 로컬 최소치와 최대치의 농도 클러스터 맵 일련 플롯 메트릭들의 일반적인 포토 순서리스트, 즉, 최소, 최대, 최소 / 최대 오버랩, ..., N 번째 극한치 같이 계산 될 수있다. 요컨대, 어느 정도 평활화 된 곡선은 주파수 데이터 포인트는 극값 인 포장 방법에 밀접 결정 맞게. 겹치지 극값의 큰 클러스터링은보다 Q가된다. 이론적으로, Q는 t에 기초하여 전체 이미지 선명도를 나타냅니다별개의 입자 크기 분포의 고.
부울 CR 사실인지 여부는 극값의 순서에 따라 달라집니다. 도 3a에서, 정렬 된리스트는 최소, 최대 및 Savitzky-골 레이 곡선의 특성에 기초 극값 겹치는 순서가 될 것이다. 그림 3a는 이미지 보정을해야 할 수 있습니다 사용자에게 제안, 보정되지 않은 이미지, 참으로 극값 플래그 CR이 일반적인 순서를 나타 내기 때문에. 나아가, 이는도 3b에서,이 목록은 동일하지만, 제 1 최소의 배제와 것이라고 볼 수있다. 따라서 이상적인 보정되지 않은 및 보정 이미지의 측정은 측정 하였다. 이러한 측정에서의 편차를 보정하는 화상을 신고 및도 3c에서의 높은 배경 잡음 멤브레인의 경우와 같이, Q ≤ 0의 감소 일반적으로한다. 선택에이 규정을 적용밝기와 배경 잡음에 관해서 우수한 이미지에 겸손, 보정 이미지 카운트 (도 3D, E는 각각 2.9 ± 0.3 21.7 % 대 ± 1.9 %) 보정되지 않은 이상 수동 계산에 상당히 가까운 것이 분명하다. 보정되지 않은 분석을 위해 선택된 이미지의 전반적인 품질 (감안할 
= 0.71 ± 0.04; ) ± SE를 의미, 거기 교정 다음 만 Q의 예상 완만 한 증가 ( = 0.90 ± 0.04). 종합적으로, Q는 CR 반면, 이미지의 전체적인 countability 전위 보정이 성공적인지 여부의 강한 지표가 나왔다.
두 세포 농도 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터의 비교 타이밍
예상대로도 4a는 사용자 1 CCC 교정 평균 약 5 분에 복용, 함께, 실질적으로 빠른 사용자 2 이상이고, 사용자 1과 2 사이 CCC 교정 시간을 비교합니다. 수동 혈구 계산 및 자동 요금을 비교하기 위해, 집계 카운터를 사용하여 계산의 수동 속도는 혈구 실의 9 개의 이미지를 가지고하는 데 걸린 시간을 비교하고, CCC (그림 4B)에서 계산. 1.15 × 106 세포의 통상적 인 세포 농도 / ㎖의 1X 처리량 증가 평균 선도 타이밍을 비교하기 위해 사용 하였다. 이 비율은로로드 셀의 개수에 따라 달라질이미지를 캡처하고 처리하는데 걸리는 총 시간 같은 혈구 세포 수와 무관하다.
마지막으로, 막, TC 내의 정량화하고 이러한 이미지를 수동으로 조정 화상 취득 타이밍을 둘러싸는도 4c에서 측정 하였다. 특히, 저 세포 수 (= 총 10,571 세포) 상당한 배경 염색 및 세포 파편 12 마이그레이션 분석 막은 셀 번호를 수동으로 조정할 필요 최악의 시나리오를 용이하게하기 위해 선택되었다. 이는 원치 않는 계수를 제거하고 부재중 세포를 추가 13 분의 평균 걸렸다도 4C 조정 (ADJ) 열에 반영된다. 수동 계산 비교를 들어, 최적의 셀 계산 속도는 셀 카운터로 측정 하였다; 높은 세포 밀도로 고품질 막을 이미지 (결과 미도시)를 사용 하였다. 이는 9.1 × 103 세포 / H의 사용자 1과 2 사이의 평균 최대 레이트를 수득(~ 2.5 세포 / s) 등이 있습니다. 이 번호를 사용하여,도 4c에서 막은 빠르게 TC와 최대 매뉴얼 속도 예상되는 것보다 4.4 배를 계산 하였다. 시간 절감이 거의 없거나 전혀 조정 및 높은 세포 밀도 (~ 7,000 세포 / 막)이 필요 이주 막을 카운팅함으로써, 세포 수 및 이미지 품질에 직접적으로 의존하는, TC는 세포 수 빨리 최대 매뉴얼 속도보다 1,395x 생성.
그림 1 : 세포 농도 계산기. 40X 총 배율로 촬영 한 혈구의 중심 주 광장 (A) 위상차 현미경 사진. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. (B) A는 혈구를 측정하기 위해 어떤 길이 묘사 (A)에서 이미지의 버전을 잘립니다. 결과 창 길이 열이 쉽게 식별 강조했다. 노란색 막대= 1 mm이다. (C) 1600 X 1200 픽셀의 해상도로 40 배의 총 배율로 현미경 및 소프트웨어 교정 후 HTR8 세포를 포함하는 혈구 이상적인 현미경. 스케일 바 = 200 μm의. (D) 세포 농도 계산기를 사용하여 동일한 이미지의 자동 카운트에 비해 ImageJ에 플러그인 셀 카운터를 사용하여 수동 수를 비교 산점도. 여기서 n은 = 57 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마이그레이션 분석은 대표 이미지에 대응. (A) 상단 패널은 최소한의 배경으로 이상적인 이미지를 묘사하는 총 막의 팔분의 일 부분이다; 스케일 바 = 200 μm의. 그만큼하부 패널은 심각 자동 계산의 정확성에 영향을 미치는 중요한 배경 염색 이미지를 포함, 스케일 바 = 585 μm의. (B) 상단 패널은 부정확 한 수를 생산 좋은 품질의 어두운 이미지를 나타냅니다. 바닥 판은 Flatfield () 현재 보정 후의 동일한 화상의 가산 버전이다. 스케일 바는 593 μm의 =. (C)의 상단 패널 나타내는 확대 된 일반적인 멤브레인의보기. 하판은 ImageJ에 원하는 색 임계이어서 동일한 이미지 (RGB 임계 값 = 150, 120, 0) 간 배경과 시각적으로 염색 세포질의 대부분을 제거한다. 모든 이미지는 헤 마톡 실린 염색 HTR8의 여러 마이그레이션 분석 침략에서 2592 X 1944 픽셀의 해상도로 보정 해부 범위와 1.35X 총 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의 =. 경쟁하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 WA 더 큰 버전.
그림 3 : 교정 및 마이그레이션 분석 ㄴ ounter의 검증. (A) 높은 품질의 보정되지 않은 이미지의 전형적인 예입니다. 마이그레이션 분석 카운터의 재계> '추천 크기'를 사용하여 (B) (A)의 보정 된 버전. (C) 상당한 배경 얼룩 또는 전체 어둠 낮은 화질 막의 전형적인 주파수 플롯. (D)를 ImageJ에 플러그인 셀 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터 자동 카운트를 사용하여 수동 수를 비교 산점도. (E) 보정되지 않은 자동 카운트 대 교정의 평균 %의 차이를 보여주는 막대 그래프. 데이터는 ± SE 평균입니다. P <0.0001, N = 30, 웰치의 corre와 짝 t-test를ction. 같은 이미지가 D에 사용하고, 모두의 E. 교정이 재계> '추천 크기'와 재계>로 이루어졌다 '수동 설정'은 또한 최소 크기 계산 및 컬러 임계 값을 수정합니다. 없음 수동 카운트 조정 함수 '카운트 열기 이미지'를 사용하지 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 세포 농도 카운터 및 마이그레이션 분석 카운터 사용의 타이밍. CCC 교정 시간 (A) 비교 (1 단계, 2) 사용자 1 (CCC / TC 전문가) 및 사용자 2 (CCC / TC 초보자) 사이. (B) 수동 셀 카운팅 시간은 다섯 가지 실험에 대해 평균 및 분당 카운트 세포에서 발현되었다. 사설C 카운트 혈구 챔버의 9 개의 이미지를 캡처하는 평균 시간으로 계산 CCC로 계수 하였다. 사용되는 세포 농도는 ~ 1.15 × 10 6 세포 / ㎖이었다. 데이터는 ± SE 평균입니다. 10.4 단계들 (QNT, 기본 구성 설정 사용 10.1-10.3.3 단계), 정량, 수집 (7 단계와 8 ACQ), 및 수동 조정 (ADJ를 : N = 5 (C) 트랜스 웰 카운터 타이밍 세 이상 카테고리를 비교 하였다 -1.4.2). 정량 세포막 정확한 카운트 상당한 수동 조정을 필요로하기 위해 배경 염색과 파편 높은 수준이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중요한 단계, 문제 해결 및 제한 사항
자동화 된 계산 방법의 특성상 입자 분석의 상세들은, 이들 입자를 정의하는 수학적인 기능을 필요로한다. 따라서, 세포 농도 계산기 마이그레이션 분석 계수기 모두의 정확도는 상기 캡쳐 된 이미지는 세포 샘플 또는 마이그레이션 분석 막과 유사한 방법에 가깝게, 즉 이미지 충실도 majorly에 의존한다. 따라서 가능한 한 가장으로 현미경 및 관련 소프트웨어 보정 프로토콜을 수행 할 수있는 최상의 중요하다. 이는 배경 잡음을 제한 불필요한 입자를 감소 밝고 균일 합초 이미지 캡처 및 TIFF와 같은 비 손실 파일 형식으로 저장 포함한다. 따라서, 두 플러그인은 이러한 요건이 충족되지 않은 경우에 잘못된 결과를 생성 할 가능성이있다. 퍼펙트 세포 수에 따라서 항상 좋은 연습 때 두 í에 그들은 시각적 인 기대와 일치하는지 확인하는 것입니다티. 만약 참 결과가 문제 (10.4 주)를 명료하게 도움이 될 바이너리 이미지와 원본 이미지를 비교하여 일치하지 않는다. 어떤 경우에는, 더 어두운 마이그레이션 분석 사진 컬러 임계치 한계 내에 화소 값에 의한 계산 된 큰 영역을 포함 할 수있다. 일반적으로, Flatfield () 현재의 이미지를 사용하는 것은 어둠과 반점을 제거하고 색의 요철로 인해 가장 원치 않는 수를 방지 할 수 있습니다.
이 가능하고 상대적으로 일반적인 문제를 감안할 때, 그것은 자연 출판 그룹 및 기타 (13)에 의해 제안 된 것과 같은 표준 이미지 무결성 지침을 따르는 것이 중요합니다. 일관된 수를 유지하기 위해, 하나의 이미지에 대한 조정은 모든 다른 사람에게 동등하게 적용되어야한다. 이 포함되지만, 채도, 밝기, 콘트라스트 이득에 한정되지 않고, 예컨대 평균화 선명도, 색 필터 등의 필터를 포함한다. 감마 조정은 픽셀 컬러의 비선형 변경 적용 피해야과 다르기 때문에, 각 화상에 영향을 미칠 수있다LY 14. 몇 가지 세포와 이미지에 공통의 노출 시간을 적용 할 때 (<1000)이 과다 노출 및 이미지 충실도의 손실을 초래할 수 있습니다. 반대로, 수천 개의 세포를 가진 멤브레인 노출 부족을 방지하기 위해 높은 노출 시간을 필요로 할 수 있습니다. 따라서, 달성 가장 높은 이미지 충실도를 유지하기 위해 가능한 한 작은 한 경우에만 필요에 따라 이미지를 조정하는 것이 좋습니다.
심지어 높은 충실도 이미지로, 진정한 입자 수는 원치 않는 입자에 의해 심각하게 왜곡 될 수 있습니다. 샘플은 세포 파편 상당량 포함되어 있으면 특별히 현탁 세포와 동일한 부분의, 세포 농도 계산기를 사용하는 경우,이 결과를 왜곡 할 수있다. 파편을 최소화 할 수없는 경우는 어떤 경우에는,이 자동 분석을 방지 할 수있다. 마찬가지로, 유사한 색상의 배경 염색 높은 수준을 함유 마이그레이션 분석 멤브레인은 멤브레인의이면으로부터 제거되지 않은 세포 또는 세포를 염색하는 것 I를 만들어n 정확도 결과. 이 원하지 않는 입자는 일반적으로 몇 가지 방법으로 제거 할 수 있습니다 : 광원의 밝기 나 노출 시간을 증가, 더 엄격한, 또는 수동으로 '카운트 열기 이미지'(10.4)를 통해 제거 할 색상 임계 값을 수정. 이 프로토콜은 정밀도를 유지하고 CCC TC에 필요한 이미지의 최적 품질을 제공하는 것이 중요하다. 그러나, TC는 일반적으로 단지 수동 조정 (10.4)에 소요되는 시간을 더 필요로 훨씬 적은 품질, 가변 배율 또는 다른 색 얼룩의 이미지를 카운팅 할 수있다.
모든 이주 검정 멤브레인 화상의 교정시는 고려 화상의 해상도와 세포의 상대적인 크기를 취하는 것이 중요하다. 전술 한 바와 같이, 이미지 품질 (Q) 및 교정 추천 (CR)는 입자 영역의 주파수 플롯 통계에 따라 달라집니다. 분석 된 이미지의 각 셀의 평균 1 / 100,000에 소요전체 이미지 영역입니다. 작은 셀 크기의 비율로 화소 단지 수백만의 이미지를 사용하는 경우, 셀 사이즈의 변화는 작다. 즉, 분산이 단지 10 내지 60 픽셀의 범위 일 수있다. 화상 영역 비율이 셀 면적이 커질수록하지만 세포의 분포는 특정 영역의 주파수를 감소시킴으로써 셀 크기 정규 분포의 첨도를 줄여 증가 크기. 명확한 극소 영역을 판별 할 수 없기 때문에 차례로이 셀 영역의 자동 계산이 더 어렵거나 불가능하게 만들 수있다. 마찬가지로,이 또한 (<50) 다른 세포 크기의 주파수가 매우 낮은 될 수있는 위치 세포의 몇 가지 숫자 이미지에 적용됩니다. 본 연구 또는 셀 크기의 다른 배포판으로 사용되는 것보다 상이한 해상도 이미지를 분석 할 때, 그 결과, 세포의 크기 범위의 수동 식별은 (10.3.3)이 필요할 수있다.
의의 및 향후 방향
ImageJ에 플러그인 셀 카운터는 처음 rele했다박사 커트 드 보스에 의해 2001 년에 ased이 일을 수동으로 세포 계수에 대한 주식을 역임했다. 생물 공동체를위한 자유롭게 사용할 수있는 도구의 추세를 계속하려면, 셀 농도 계산기 및 마이그레이션 분석 카운터는 처리량 및 마이그레이션 분석의 간 실험 재현성을 높일 수 있도록하는 무료 도구의 다음 단계를 제공합니다. 마이그레이션 분석의 최종 결과는 파종 세포 수에 크게 의존한다. 고로 안정적인 세포 수 재현성에 대한 필요성이다. 이러한 방식으로, 두 CCC 인해 세포 농도 및 셀 상태를 유지 짧은 카운트 배 높은 통계적 확실성 정확도를 증가 제공한다.
또한, 양 플러그의 최종 결과는 세포 수의 카운트가 아닌 형광 물질로서 상대 인덱스이다. 다양한 다른 프로토콜은 염색 후 그 측정 형광 존재하지만, 이러한 방법은 감도 (13)의 부족으로 고통 받고 있습니다. 어도비의 포토샵 자체 입자 분석 t을 제공합니다OOL하지만 프로그램이 사용하기 위해 구입해야합니다 및 마이그레이션 분석 카운터 (20)에서 사용할 수있는 포스트 계수 분석을 제공하지 않습니다. 두 플러그인 ImageJ에의 입자 계수 기능에 의존하고 따라서 ImageJ에 의해 사용되는 매크로를 편집하여 최종 사용자에 의해 수정 될 수있다. 이것은 사용자가 새로운 매크로를 작성하여 다른 입자에 플러그인의 범위를 확장하기위한 유연성을 제공합니다. 최종 사용자의 기여를 가산 입자의 폭을 증가시키고 통합하는 발전 다음 논리적 단계이다. 자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 계수 분석 세포 카운터의 핵심 원리를 조합하여, 이것은 크게 마이그레이션 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins : 플러그인은에서 설치 지침을 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 - 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides - Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293 | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth - 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
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