Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54732
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

Summary

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

Introduction

מאמר זה מספק assay אמין לדווח הביטוי שטח פני התא היחסי של חלבונים בממברנה כגון תעלות יונים לידי ביטוי בתאים רקומביננטי באמצעות טכנולוגית cytometry הזרימה הקיימת. תעלות יונים הן חלבונים בממברנה נקבוביים יוצרים שאחראים לשליטת אותות חשמליים על ידי gating את זרימת יונים על פני קרום התא. הם מסווגים על ידי מנגנון הפעלה, טבע, סלקטיביות של מינים יון העוברים דרך הנקבוביות שבו הם נקודתיים. ברמה התאית ורקמות, והנתיבים יון מקרוסקופית דרך תעלות יונים הם תוצר של biophysical (gating ו חלחול), ביוכימיות (זירחון), ו biogenesis (סינתזה, glycosylation, סחר, השפלה) נכסים 1. כל התהליכים הללו הוא ייחודי לכל סוג של תעלות יונים, והוא מותאם למלא את התפקיד הפיזיולוגי של ערוץ יון. כתוצאה מכך, שינויים בכל תהליכים המכוילים אלה באמצעותבירושה או הנדסה גנטית, המכונה לעתים קרובות "channelopathy", יכול להיות מזיק הומאוסטזיס תא. חשוב להדגיש, כי מסירת הסכום "הנכון" של תעלות יונים על פני התא היא קריטית הומאוסטזיס תא. גם עליות קטנות (רווח של פונקציה) וירידה קטנה (הפסד של פונקציה) בפעילות ערוץ יון יש פוטנציאל לגרום פתולוגיה רצינית לאורך החיים. פגמי המשלוח פני התא של תעלות יונים בוגרות הוא הקובע חשוב channelopathies רב, כגון סיסטיק פיברוזיס (ערוץ יון CFTR) 2 ו הפרעות בקצב לב של טופס תסמונת QT הארוך (תעלות אשלגן לב) 3.

Channelopathies המשויכים מוות פתאומי של הלב 4. שהשכיחות העולמית הנוכחית של כל channelopathies הלב נחשב לפחות 1: 2,000-1: 3,000 לנפש 5 ואחראים כמחצית ca למוות קרדיאלי פתאומי בקצב לא סדירses 6. תפקוד לקוי של נתרן מתח מגודר לב, potassium-, ו בסידן תעלות יונים סלקטיבי ידועות לשחק תפקיד מרכזי בתהליך זה. The L-סוג Ca V 1.2 תעלות סידן מתח מגודרת נדרש ליזום התכווצות שריר הלב מסונכרן. הלב L- סוג Ca V 1.2 ערוץ הינו קומפלקס חלבון רב-למקטע מורכב למקטע α1 הראשי יוצרי הנקבוביות Ca V ו- CA V SS ו- CA V α2δ1 יחידות משנה עזר 7-12. ראוי לציין, כי ההשלמה המלאה של יחידות משנת עזר נדרשת לייצר ערוצי Ca V 1.2 פעילות לפי קרום הפלזמה ואינטראקציות דינמיות בין יחידות המשנה אלה חיוניות כדי לתמוך בפונקציה החשמלית הרגילה של הלב 13. Ca V SS מקדם את הביטוי על פני קרום התא של Ca V 1.2 ערוצים באמצעות אינטראקציה הידרופובי nanomolar הלא קוולנטיים 14. שיתוף ביטוי של wi למקטע Ca V α2δ1ה Ca V SS הנכנס Ca V α1 מגרה ביטוי השיא הנוכחי (5 עד פי 10) ומקדם ההפעלה ערוץ במתח שלילי יותר. קבל של פונקצית מוטציות של למקטע יוצרי הנקבוביות Ca V 1.2 נקשר עם צורה של הפרעות קצב חדריות שנקראת תסמונת QT הארוך 15 בעוד שורה של מוטציות נקודתיות בשלוש היחידות משנה הראשיים להרכיב ערוץ L- סוג Ca V 1.2 זוהה במקצועות הסובלים הפרעות קצב של טופס תסמונת QT הקצר 16,17. תעלות יונים הן חלבוני בממברנה שניתן לחקור מנקודת מבט ביוכימית (כימית חלבון) או באמצעות כלי אלקטרו (מכונה ייצור הנוכחי) ולעתים קרובות תוך שימוש בגישות משלימות אלה. אלקטרופיזיולוגיה, ב תיקון- clamping כל תא מסוים, היא פתרון ראוי להבהיר את הפונקציה של תעלות יוני 15 אבל לא יכולה לפתור שינויים בסחר חלבון משינויי biophysical שלהםנכסים. כימית חלבון יש, עם זאת, לעתים קרובות שימוש אפשרי מוגבלת בשל הביטוי הנמוך היחסי של חלבונים בממברנה גדולים ביחס חלבונים מסיסים קטנים. שיטות תפוקה גבוהה חזקות באמצעות הודעת קרינה צריכות להיות מפותחות על מנת לתת מענה ליקויים דווקא biogenesis חלבון גורמים לשינויי הביטוי פני התא של תעלות יונים.

Cytometry זרימה היא טכנולוגיה biophysical מועסק ספירת תאים, מיון, איתור סמן ביולוגי, והנדסת חלבון 18. כאשר פתרון מדגם של תאי חיים או חלקיקים מוזרק לתוך cytometer זרימה, התאים מסודרים לזרם יחיד שיכול להיות נחקר על ידי מערכת זיהוי של המכונה (איור 1). התזרים הראשון cytometer המכשיר המיוצר ב -1956 19 זוהה רק פרמטר אחד אבל cytometers הזרימה המודרני יש לייזרים מרובים גלאי קרינה המאפשרים זיהוי של יותר מ -30 פרמטרי ניאון 20,21.מסננים ומראות (אופטיקה פליטה) לכוון את פיזור האור או אור הניאון של תאי רשת אלקטרונית (פוטודיודה וגלאים) הממירה את אור יחסי עוצמתו. נתונים דיגיטליים מנותחים באמצעות תוכנות מיוחדות הפלט העיקרי מוצג כמזימת נקודה 21.

איור 1
איור 1:. עקרונות Biophysical של זרימת cytometry מיון תאים בודדים נדחפים דרך נחיר בלחץ גבוה בתוך זרם של נוזל נדן אשר נע אותם על אחד או יותר נקודות החקירה לייזר. אלומת האור היא מוסחת על ידי התאים עוברים והאור שנאסף בכיוון קדימה (Forward הפיזור, FCS) נשלח פוטודיודה הממיר האור לאות ביחס ישירה לגודל של התא. האור נאסף גם בזווית של 90 ° לנתיב לייזר ונשלח גלאי (המכונה גם photomultipliers (PMT)).אור זה מנותב דרך מראות dichroic המאפשרות זיהוי של אות הפיזור בצד (SSC), המשקפת את הגרעיניות בתוך התאים, ואת פליטת פלורסנט אם fluorochromes הנרגש נוכחים בתא. שלושה גלאים (ירוק, צהוב, אדום) מיוצגים עם מסננים bandpass אורך גל שונה, מה שמאפשר זיהוי סימולטני של fluorochromes שונים. האותות השונים דיגיטציה ידי למחשב חיצוני והוסבו נתונים שינותחו לכמת את המאפיינים של התאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קיבולת התפוקה הגבוהה של cytometers הזרימה נוצלה לכמת את ביטוי הקרום היחסי של סוג-בר רקומביננטי מתח מגודר סחר מחסר L- סוג Ca V 1.2 ערוצים יחידים משנה הקשורים בתאים חיים. בונת cDNA שיתוףדינג עבור החלבונים תויגו כפליים לבצע אפיטופ ללא ניאון תאי זמנית שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן מצומדות ניאון בלתי חדיר ו fluorophore תאי כי הוא פלורסנט constitutively. הן epitope התאית, הוכנסה בלופ תאי של החלבון, ואת fluorophore התאי, מוכנסת לאחר C- הסופית, מתורגם עם החלבון. בסדרה זו של ניסויים, חלבון Ca V α2δ1 תוכנן להביע hemagglutinin התאי epitope (HA) (YPYDVPDYA) זוהה על ידי (isothiocyanate והעמסה) FITC בלתי חדירה, מצומדות אנטי-HA ו mCherry כמו fluorophore התאי המהותי. כדי לקבוע את רמת הביטוי שטח פני התא היחסי של α2δ1 V mCherry-Ca HA-tagged חלבון, תאים רקומביננטי המבטאים את החלבון היתוך נבצרו לאחר transfection, ומוכתם antibod תג FITC- מצומדות העכבר חד שבטיים אנטי-HA epitopey (איור 2). FITC הוא תרכובת אורגנית ניאון כי הוא קטן יותר באופן משמעותי מאשר כתבים האנזים ולכן לא צפויות כמו להפריע לתפקוד ביולוגי. mCherry- Ca V α2δ1-HA ביתר TSA-201cells, מייצר גידול של 3-יומן משמעותי את קרינת FITC ו mCherry הקרין על מגרשים דו ממדים 22. בהתחשב בכך epitope HA ממוקם בחלק התאי של החלבון, את עוצמת הקרינה עבור FITC שהושגה בנוכחות של תאים שלמים לשקף את המדד היחסי של הביטוי על פני קרום התא של חלבון HA-tagged. הנגישות של epitope HA של המבנים הוא תוקף באופן שיטתי על ידי מדידת האות FITC לאחר התא permeabilization. מדד זה משמש גם כדי לאשש את ביטוי חלבון הכולל המנורמל מאז עוצמות קרינה היחסיות עבור FITC מוערכות בתאי permeabilized הם איכותיים להשוות את ערכי הקרינה היחסיים FOr mCherry נמדד בתנאי permeabilized והלא-permeabilized 22,23. חשוב לציין כי ספקטרום קרינה הפנימי מוסט לכיוון ערכים גבוהים יותר לאחר permeabilization אבל זה הערך היחיד שדווח הוא השינוי בעוצמת קרינה לעומת המבנה השליט. שינויים יחסיים בעוצמת הקרינה עבור המבנים הבדיקה מחושבים באמצעות עוצמת הקרינה ΔMean (ΔMFI) ערכים עבור כל fluorophore (mCherry או FITC). ניסויים נועדו למדוד את עוצמת הקרינה של יחסי מבחן לבנות את עוצמת הקרינה של מבנה השליטה לידי ביטוי באותם תנאים להגביל וריאציות ניסיוני הקרינה הפנימית של הנוגדן מצומדות fluorophore. שני חלבונים בממברנה נחקרו בהצלחה באמצעות assay: למקטע יוצרים הנקבובי של תעלות סידן L- סוג המתח מגודרת Ca V 1.2 14,22 ו בסדרה שונה שלניסויים, למקטע תאיים עזר Ca V α2δ1 22,23. הפרוטוקול הבא שמש כדי לקבוע את הביטוי על פני קרום התא של למקטע Ca V α2δ1 של L-סוג הלב Ca V 1.2 ערוץ בתנאים מלאים לאחר מוטציות המשפיעות על שינוי posttranslational של ערוץ היון. תחת תנאי ניסוי סטנדרטיים, הקרינה פני התא של FITC מגבירה מעין-ליניארי עם הביטוי של cDNA מקודדי חלבוני mCherry-Ca V α2δ1-HA (האיור 5 בהפניה 22).

איור 2
איור 2:. ייצוג סכמטי של תיוג סך קרום בזרימת cytometry פרוטוקול הניסוי התוכנית מתאר כמה מן השלבים העיקריים הדרושים כדי לכמת את הביטוי הכולל ותא השטח היחסי של תעלות יונים רקומביננטי ידי flow cytometry. תאים הם transfected עם בניית פעמים מתויגות mCherry-Ca V α2δ1-HA בתאי TSA-201 (1) ו מוכתמים לפני או אחרי permeabilization (2). נתוני פרמטרים מרובים נרכשים cytometer זרימה (3) עבור ניתוח רב משתנה (4). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בונה DNA Tagged כפלים

  1. הכנס את epitope HA (YPYDVPDYA) ב והמקשר התאי של α2δ1 Ca V בין D676 ו- R677 על ידי mutagenesis באתר ביים (איור 3 ב) 20. השתמש קדימה פריימר gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC הפוך acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC פריימר.
  2. Subclone רצף cDNA של α2δ1 V HA Ca מתויג לתוך וקטור ביטוי pmCherry-N1 היונק נועד לבטא את החלבון התמזג N- הסופית של mCherry בין אתרי SACI ואת סאלי (איור 3B) 20.
    הערה: תפקוד ערוץ מתאים צריכה להיבדק עם המבנה השליט באמצעות שיטות אלקטרו תקן 24.

2. Transfection חלוף בתיווך Liposome (30 דק ', כל הצעדים מבוצעים מתחת למכסת מנוע לזרום למינרית)

  1. יום 1: פלייט חצי מיליון תאים TSA-201 (או HEKT) ב35 מ"מ תרבות מנות עם 2 המדיום החיוני המינימום הגבוה גלוקוז של המ"ל של Dulbecco (DMEM-HG) בתוספת 10% עובריים שור סרום (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (PS) בינוני תרבות. ספירת תאים באמצעות hemacytometer תקן. הערכת כדאיות התא מן שבריר של המדגם התא באמצעות Trypan כחול. פלייט תאים מספיק כדי להגיע למפגש 90% בזמן transfection.
  2. יום 2: שינוי התרבות בינוני עם 2 מ"ל של טרום התחמם טריים (37 ° C) בינוני תרבות ללא PS.
  3. עבור כל דגימה transfection, להכין שני צינורות 1.5 מ"ל. בשנת צינור 1, לדלל 4 מיקרוגרם של ה- DNA ב 250 μl של מדיום סרום מופחת. בשנת צינור 2, לערבב 10 μl של מגיב transfection בתיווך ליפוזום עם 250 בינוני תרבות μl-מופחת בסרום. מערבבים בעדינות מגיב transfection לפני השימוש.
  4. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מערבבים את תכולת שפופרת 1 צינור 2, מערבבים בעדינות דגירה לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. מוסיפים את ליפוזומים / DNקומפלקסים אל התאים בתרבית בעדינות לטלטל את מנת התרבות לערבב.
  7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 אווירה למשך 24 שעות.

3. צביעת תאים עבור cytometry זרימה (3 שעות)

  1. הכנת דגימות תאים
    1. יום 3: הסר בינוני מצלחת התרבות בזהירות לשטוף את התאים עם 400 μl של טרום התחמם (37 ° C) 0.05% טריפסין-1x EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic).
    2. להוסיף 400 μl של טריפסין-EDTA דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 אווירה במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק המנה.
    3. עצור את העיכול אנזים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום תרבות קר ללא PS ולשטוף את כל התאים מפני השטח על ידי pipetting בעדינות 4-5 פעמים. הימנע יתר העיכול יתר pipetting להפחית מוות של תאים.
    4. איסוף תאים ב 1.5 מ"ל צינורות ומניחים מיד על הקרח. השתמש בפתרונות קרים קרח ולשמור את התאים ב 4 ° C כדי למנוע ההפנמהשל פני השטח אנטיגנים. ירידת תאורה להגביל photobleaching של אות הניאון.
    5. צינורות צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant.
    6. Re- להשעות גלולה ב 1 מ"ל של 1x שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) כדי להכין ההשעיה תא בודד.
    7. בקצרה מערבולת הצינורות מאוד בעדינות וחזור על שלבים 3.1.5 ו 3.1.6 להסיר בינוני תרבות לחלוטין.
    8. Re- להשעות גלולה ב 600 μl של 1x PBS ולהתאים את ריכוז התאים עד למינימום של 3 x 10 6 תאים / מ"ל.
    9. מחלק את התאים בשני 1.5 מיליליטר צינורות חדשים עבור מכתים תאי ו תאי. כלול בקרות מתאימות להיפלות מכתים ספציפי מכתים הלא ספציפי.
      הערה: נוגדן אלוטיפ עוזר בהערכת רמת מכתים רקע אידיאלי צריך להתאים לכל מין המארח של נוגדן ראשוני, אלוטיפ ו fluorophore. השתמש בפקד אלוטיפ נוגדנים מצומדות באותוריכוז החלבון.

שולחן 1
טבלת 1: דגימות בקרת ניסוי-cytometry זרימה בלתי permeabilized ו permeabilized תאים כל ניסוי צריך לכלול את השולטת השלילית הבאה:. (1) תאי Nontransfected (ללא נוגדנים, עם אלוטיפ או עם נוגדן מצומדות). (2) תאי transfected עם החלבון של עניין subcloned פלסמיד ללא fluorochrome תאי פלורסנט מכונן (ע"א pCMV- α2δ1-HA) או עם הבנייה מתויגת כפליים (pmCherry-Ca V α2δ1 וטופח ללא נוגדנים, עם אלוטיפ או עם נוגדן מצומדות). צבע שולט יחיד משמש פיצוי של חפיפת פליטת fluorochrome. באותם אמצעי השליטה מנוהלת עבור הלא-permeabilized ו permeabilized תנאים בכל סדרה של ניסויים.

  1. מכתים פני התא של Intactבתאים חיים
    1. Aliquot 1 x 10 6 תאים / 100 μl ב 1.5 מ"ל צינורות.
    2. מוסיף את הנוגדן אנטי HA monoclonal FITC- מצומדות ב 5 מיקרוגרם / מיליליטר ו, מערבולת לפני דוגרי התאים על פלטפורמת נדנדה (200 סל"ד) בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
      הערה: הריכוז האופטימלי של נוגדנים נקבע בניסויי טיטרציה ראשוניים (איור 4).
    3. הסרת תאים מן החשכה להוסיף 900 ​​μl של / צינור 1x PBS. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    4. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS 1x, מערבולת ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    5. חזור על לשטוף (שלב 3.2.4) פעמים כדי להסיר כל נוגדנים מאוגדים. אם נוגדן ראשוני unconjugated משמש, דגירה עם נוגדנים משני המתאים.
    6. לאחר שטיפה של דבר, resuspend התאים 500 μl של PBS 1x ולהעביר את ההשעיה תא בודד ב 5 מ"ל cytometry זרימה צינורות. שמור התאים בחושך ב 4 ° C. עד פועל המדגם.
    7. הפעל את הדגימות על cytometer זרימה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנתח את התאים על זרימת cytometer בהקדם האפשרי ולא יאוחר מ -24 שעות לאחר.
  2. מכתים תאי: קיבוע, Permeabilization, מכתים
    1. Aliquot 1 x 10 6 תאים / 100 μl ב 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    2. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 100 μl של פתרון קיבעון-permeabilization ישירות ממלאי.
    3. דגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
    4. הוספת 100 μl של חיץ permeabilization לשטיפת 1x מוכן טרי (לדלל 10x חיץ permeabilization לשטיפת ב O H 2 מזוקקים). תאים וורטקס ומשקע באמצעות צנטריפוגות שולחן ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. לשאוב וזורקים supernatant.
    6. חזור על שלבים 3.3.4 ו 3.3.5.
    7. להוסיף monoclonal FITC- מצומדות נוגדן אנטי HA ב 5מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 100 μl של חיץ permeabilization לשטיפת 1x ו, מערבולת לפני דוגרים תאים בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: המכתים התאי מתבצע בעקבות ההליך אותו לזו שבוצעה עבור שטח פני תא מכתים. סאפונין בתיווך התא permeabilization עם זאת, תהליך הפיך במהירות, ולכן חשוב להחליף PBS 1x עם חיץ 1x פרם / Wash לשמור על התאים בנוכחות מתמדת של saponin במהלך מכתים תאיים.
    8. הסרת תאים מן החשכה להוסיף 100 μl חיץ לשטיפת permeabilization. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    9. לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלולה ב 100 μl חיץ לשטיפת permeabilization, מערבולת ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    10. חזור על לשטוף (שלב 3.3.9) עוד פעם אחת כדי להסיר כל נוגדן מאוגד.
    11. לאחר שטיפה של דבר, resuspend התאים 500 μl של PBS 1x ולהעביר את החטאהשעית תא GLE עד 5 זרימת מיליליטר cytometry צינורות. שמור את התאים בחושך ב 4 מעלות צלזיוס עד הזרקת המדגם לתוך זרם cytometer.
    12. הפעל את הדגימות על cytometer זרימה. הפעל את הדגימות הקבועות על cytometer בהקדם האפשרי אך לא יאוחר מיום 1 שבוע לאחר צביעה. הפעל את התאים הלא-permeabilized ו permeabilized באותו יום.

4. Cytometry זרימה

  1. Cytometer זרימת הגדרת תא הסדרן יומי
    1. הפעל את תוכנת cytometry הזרימה. לפני להתנסות, לכייל ולהתקין את הזרימה cytometer סדרן תא כדי להבטיח ביצועים אופטימליים מכשיר (ליזר כלומר ואופטיקה מתפקדת למפרט, הליזר וזרימת תא מיושר כראוי) באמצעות חרוזי התקנה מכשירה.
    2. השתמש זרבובית 100 מיקרומטר עם לחץ נדן 20 psi.
      הערה: הזרבובית אינה צריכה להיות שונה על ספסל לזרום cytometer.
    3. הגדר את קצב הזרימה של cytometer פי manufacturמפרט אה. מאוד גבוהי זרימת שיעורים יקטנו רגישות זיהוי של וריאציות קרינה.
    4. בחר כחול (488 ננומטר לרגש והעמסת Isothiocayanate או FITC) ו-צהוב ירוק (561 ננומטר לרגש mCherry) לייזרים. אסוף רמות הקרינה FITC ו mCherry עם ננומטר 530/30 ועם מסנן bandpass 610/20 ננומטר בהתאמה.
    5. רוכש את הפיזור קדימה (FCS) לעומת פיזור בצד עלילת נקודה (SSC) עבור תאים בלא כתם באמצעות בקנה המידה ליניארי. התאם כל הגברה של גלאי לדמיין התאים ברבע השמאלי התחתון של העלילה נקודה.
  2. קריאת מדגם שלם ללא permeabilized תאים
    1. הגדר את P1gate עבור תאים שאינם permeabilized חיו על ידי התוויית צורה חופשית סביב התאים להיות מנותחים למעט פסולת תא אגרגטים תא, ובכך להגביל את אות הקרינה בתאים שלמים.
      הערה: Live / צבעי הרחקה מתות ניתן להשתמש כדי להקל על מיקום שער על תאי חיים. גדר 10,000 אירועים להקליטב P1 שער עצירה. סמן את זה למספר גבוה יותר של אירועים אם יהיה בכך צורך.
    2. רוכשת mCherry לעומת העלילה מתאר שתי פרמטר FITC לזהות autofluorescence הבסיס של תאים בלא כתם. השתמש בקנה מידה דו-לוגריתמי להראות ערכים שליליים ולשפר ברזולוציה בין אוכלוסיות 25. התאם כל של מתח גלאי להגדיר את התאים השליליים בלא הכתם בתוך החלק התחתון של עשר היחידות הראשונות של החלקות עוצמות קרינת יומן.
    3. לרכוש את כל דגימות השלמים שאינם permeabilized באמצעות הגדרות הוקמו בשנת 4.1.5 4.1.6 ולאסוף FSC, SSC ו אותות גלאי הקרינה.
    4. יצוא ולשמור * קבצי .fcs לשמש לניתוח באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח.
  3. קריאת דגימת תאי permeabilized
    1. הזז את השער P1 כדי לבחור תאים חיים בדגימות permeabilized ולהתאים FSC ומתח SSC כמוצג 4.1.5 4.1.6.
    2. לרכוש את כל דגימות permeabilized ולאסוף FSC, SSCאותות nd ב גלאי הקרינה.
    3. יצוא ולשמור * קבצי .fcs לשמש לניתוח באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח.
  4. ניתוח נתונים
    1. הפעל את זרימת cytometry קבצים .fcs * ייבוא ​​תוכנה וניתוח שנשמרו 4.2.4 ו 4.3.3.
    2. הקש על המדגם הראשון רשום בחלון סביבת העבודה. חלון חדש בשם אחרי מספר מזהה צינור נפתח אוטומטית. התחילו בתהליך gating בעלילה של SSC לעומת FSC. צייר שער (P1) באמצעות סמל האליפסה סביב תאי חיים ולחסל את כל פסולת, תאים מתים, או אגרגטים אשר יש פיזור קדימה שונה ולפזר לוואי מאשר תאי חיים
    3. כדי למשוך את העלילה מתאר שתי פרמטר של mCherry (ציר y) לעומת FITC (ציר x) עוצמת הקרינה של תאים חיים, ללחוץ תחילה על ציר ה- x ולבחור את FITC-A הערוץ ולאחר מכן לחץ על y ציר ולבחור את ערוץ PE-mCherry-A. לחץ על הסמל "Quad" כדי למקם את הסמן ברבע בקצה שלתאי utofluorescent בכל ערוץ קרינה.
      הערה: השער להגדיר סביב התאים החיוביים FITC ו mCherry הוא שער P2. אוכלוסיית התאים השלילית הקרינה המכונית שער P3. ראה איור 5 עבור שיטת gating נציג שימוש במאמר זה.
    4. P2 ובחר שערים P3 ולחץ על הסמל "הוספת סטטיסטיקות" בחלון סביבת העבודה המקורית. לחץ על "רוזן" (מספר תאים החיוביים) ולחץ על "Mean" (Mean קרינת עצמה של כל fluorochrome) או "חציון" (עוצמת קרינת החציון של כל fluorochrome) סטטיסטיקה בין רשימת האפשרויות. הקש על הסמל "הוסף הסטטיסטיקה" שוב. כל הערכים הללו מועברים אוטומטית בחלון סביבת העבודה המקורי.
      הערה: "Mean" משמשת רק אם עוצמת הקרינה כדלקמן התפלגות נורמלית. בכל מקרה אחר, לחץ על הכרטיסייה "חציון". MFI ובכך יכול להתייחס Mean הקרינה Intensitעוצמת הקרינה y או חציון.
      הערה: השלב הבא הוא ליישם את הפרמטרים של גייטס וסטטיסטיקה לכל הדגימות נחקרו על ידי cytometer.
    5. בחלון סביבת העבודה, להשתמש בעכבר כדי לגרור ולשחרר את פרמטרי שערים וסטטיסטיקות על הקו מסומן כל דגימות.
    6. להפיק דוח אצווה של מגרשים מתאר דו מימדי (mCherry vs FITC) היסטוגרמות (תא לספור לעומת עוצמת הקרינה) עבור תאים שאינם permeabilized ו permeabilized (6A ומספרים - B).
    7. מהסטטיסטיקה שנוצרה בשלב 4.4.4, לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) עבור כל fluorochrome עבור התאים המוכתמים. מתוך ערך זה, להפחית את ערך MFI המתקבל תאים בלא כתם לכמת את השטח וביטוי הכולל של החלבון של עניין.
    8. דווח על ערכי ΔMFI לכל fluorophore (mCherry ו FITC) (איור 6 ג - ד). לנרמל את ΔMFI נמדד על Ca הערה: הערך המוחלט של עוצמת קרינה יכולה להשתנות בחדות בהתאם תצווה של נוגדנים ואת היכולות הטכניות של כל עובד במעבדה, ומכאן הצורך לנרמל עוצמת קרינה של לבנות מוטנטים באמצעות מבנה WT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין לכמת פנים כולל ותא של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי TSA-201cells ידי זרימת שני צבעים cytometry assay. כדוגמה, פני התא ביחס וביטוי החלבון הכולל היה לכמת עבור α2δ1subunit ע"א. על מנת לבצע את זרימת שני צבעי cytometry assay, Ca V α2δ1 תויג כפליים להביע HA epitope ללא ניאון תאי שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות ו fluorophore mCherry מכונן פלורסנט התאי. ספקטרום עירור ופליטה עבור FITC ו mCherry מראים כי FITC מתרגשת עם יעילות 88% על ידי לייזר 488 ננומטר אבל היעילות יורדת ל -0% עם לייזר 561 ננומטר. MCherry תערוכות 63.9% של הקרינה המרבית שלה כאשר נרגש עם לייזר 561 ננומטר אבל רק 7.6% עם לייזר 488 ננומטר (איור 3). -ה SPE עירור ופליטהCtra לשני fluorophores להפגין איסוף אור אופטימלית חפיפה מינימלית עם לייזרים מסננים שונים שנבחרו. Cytometry זרימת מבחנים יכולים לספק מידע כמוני על הביטוי היחסי של חלבונים בממברנה מאוכלוסיית תא גדולה כל עוד MFI עבור fluorochrome הנתון היא ביחס ישר ביטוי החלבון של α2δ1 ע"א על כל תא ולא את מספר תאי פלורסנט. הפעולה זו כוללת שימוש ריכוז נוגדן מצומדות-קרינה מעבר רוויה. עקומת טיטרציה עבור נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות מחייב α2δ1 ע"א (איור 4) מראה שלושה שלבים. אמנם אין קרינה זוהתה בשלב הראשון, את עוצמת הקרינה גדלה באופן אקספוננציאלי ככל שעלה ריכוז נוגדן בשלב השני. לאחר נקודת הרוויה (שלב שלישי), גברת הריכוז של הנוגדן אין כל השפעה על inten הקרינה היחסיצפיפות (RFI) של FITC. נקודת רווית נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות הוקמה ב 5 מיקרוגרם / מיליליטר, ובכך להבטיח כי ריכוז הנוגדן מצומדות אינו הגבלת MFI במהלך הניסויים.

ה- V Ca מתויג α2δ1was לידי ביטוי TSA-201cells ותזרים cytometry מבחני בוצעו בנוכחות האנטי-HA FITC- מצומדות בתאים שאינם permeabilized (איור 5). בקרות מתאימות (טבלה 1) נותחו על cytometer זרימת מייחסת ערכי XY לכל תא עובר דרך קרן הליזר. חלוקת התא היא מדמיינת על מגרשי נקודה (איור 5 א). FCS / מגרשי נקודת SSC לאשר, כי הכנת דגימות תאים מספקת השעית תא בודדת עם כדאיויות גבוהות (האיור 5Ba). השער שנבחר עבור תאים חיים (P1) מייצג 75% של המספר הכולל של תאים נותחו. O את ביטוי חלבון הכוללf Ca V α2δ1 בתאים TSA-201 נחשב פרופורציונלי הקרינה mCherry. כפי שניתן לראות המגרשים קונטור mCherry לעומת FITC היסטוגרמות (איור 5Bb - Bc), 47 2% TSA-201 תאים transfected עם pmCherry-Ca V α2δ1-HA נמצאו להביע הקרינה mCherry משמעותית כמו גם מראה הקרינה FITC משמעותי בשל עקידה לתג HA החיצוני של α2δ1 ע"א בתאים שאינם permeabilized. ניסויי בקרה שליליים להתבצע ללא נוגדנים או עם אלוטיפ עולים כי FITC נקשר רק או בעיקר על תאי transfected החיובי.

פרוטוקול זה שימש כדי לאפיין את התפקיד של N-glycosylation על הביטוי הכולל תא השטח של α2δ1 Ca V ב TSA-201cells 23. ניסויים בוצעו בתאים שאינם permeabilized להעריך את הביטוי שטח פני התאו בתאי permeabilized להעריך את ביטוי החלבון הכולל, כמו גם המאשר את הנגישות של epitope HA. ביטוי יחסי של α2δ1 ע"א חושב בהתבסס על MFI מוערך לכל fluorophore (mCherry או FITC). ערכי ΔMFI עבור מוטנטים היו מנורמלים לערך המקסימאלי שנמדד באותו היום עבור mCherry-Ca V α2δ1-HA WT הביעו באותם תנאים. זה חשוב לתת דין וחשבון על וריאציות לאורך זמן עוצמת הקרינה המוחלט של נוגדן מצומדות אנטי-HA FITC. כפי שניתן לראות באיור 6 א, את ΔMFI עבור FITC בתאים שאינם permeabilized היה חזק עבור WT ואת 4xNQ לבנות אבל קרוב לרמת קרינת הרקע עבור מבנה 16xNQ כלומר החלבון הוא כמעט נעדר מן קרום הפלזמה. מבחנים שנערכו לאחר התא permeabilization, הראה כי ביטוי חלבון הכולל של מבנה 16xNQ גם ירד באופן משמעותי אם זההיה להסיק מן הקרינה FITC בתאים permeabilized או מן הקרינה mCherry המכונן נמדד הלא permeabilized ו בתאים permeabilized (איור 6 ג - ד). כפי שניתן לראות באיור 6B, ברמה התאית autofluorescence גברה לאחר התא permeabilization, המונע השוואה של ערכי קרינה המוחלטים בין תאים שאינם permeabilized ו permeabilized ללא פגע. קרינת ΔMFI נמדדה mCherry הייתה דומה בשני תאים שאינם permeabilized ו permeabilized מסמל שפתרון permeabilization אינו משנה את אות הקרינה היחסית של mCherry. מוטציות של אתרי N-glycosylation הייתה קשורה עם ירידה בעוצמת הקרינה עבור mCherry התומכות תצפית שפורסם כי biogenesis חלבון / יציבות הופחת 23. בסדרה זו של ניסויים, אות הקרינה היחסית עבור FITC נמדדה בתאי permeabilized התבררה bדואר קטן עוד יותר מאשר האות יחסים mCherry טוענת כי מצב glycosylation N-הסוג של החלבון יכול להיות השפעה על עוצמת הקרינה זוהתה על ידי נוגדן FITC- מצומדות אנטי-HA בתחום התאי. בסך הכל השינויים הקרינה היחסית של FITC לפני אחרי permeabilization תא לספק מדד אמין לכמת ביטוי חלבון.

איור 3
איור 3: FITC ו mCherry יוצרים זוג מתאים של fluorochromes עבור מבחני cytometry שני צבעי עירור (עקומות ריקות) והפליטה ספקטרה (עקומות מלאות) עבור FITC נרגשת עם 488 ליזר כחול ננומטר (Aa) ו mCherry נרגשת עם 561 ננומטר צהוב. לייזר ירוק (AB). FITC הקרינה mCherry נאספו עם 530/30 ננומטר וכן 610/20 ננומטר bandpasים מסנני בהתאמה. אורך הגל של לייזרים השונים (קווים אנכיים צבעוניים) ואת המסננים (מלבנים צבעוניים) נבחר לצורך איסוף אור אופטימלי חפיפה מינימאלית. (ב) ייצוג סכמטי של חלבון mCherry-Ca V α2δ1-HA. Ca V α2δ1 תויג כפליים להביע HA epitope ללא ניאון תאי שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות וכן fluorochrome mCherry מכונן פלורסנט התאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. טיטרציה של נוגדנים חד שבטיים אנטי-HA FITC- מצומדות מחייב Ca V α2δ1 TSA-201 תאים היו transfected זמני עם pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA וטופחו עם מגוון של נוגדנים אנטי-HA FITC- מצומדות או אלוטיפ. רק אות FITC היא להיות מנותחת בלוח זה. (א) היסטוגרמות פרמטר יחיד להצגת המספר היחסי של תאים על ציר ה- y ואת עוצמת הקרינה FITC על ציר ה- x עבור טווח נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות של ריכוזים (0.01-20 מיקרוגרם / מ"ל). (ב) גרף חצי לוג עבור נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות כפונקציה של MFI של FITC. עקומת טיטרציה הייתה מצוידת באמצעות אתר אחד כריכת משוואה עם R ערך מגמת 2 = 0.99561. טיטרציה ביצע עבור נוגדן אלוטיפ לא הראו הקרינה כצפוי. הריכוזים מ מיליליטר 0.001 ל 0.01 מיקרוגרם / הם נבדלים מן רעשי הרקע. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1 "> איור 5
איור 5: תזרים נציג cytometry ניתוח של הלא-permeabilized TSA-201cells טרנספקציה עם pmCherry-Ca V α2δ1-HA (א) ייצוג סכמטי של האסטרטגיה gating המשמשים cytometry הזרימה מדגם ניתוח.. הנתונים נותחו לאחר הרכישה עם התוכנה המתאימה. אסטרטגית gating הראשונה מנצלת פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC) עלילת נקודה להציג שער (P1) סביב תאי חיים ולחסל את כל פסולת, תאים מתים, או אגרגטים אשר יש פיזור קדימה שונה ולפזר לוואי מאשר תאי חיים . שני פרמטרים מגרשים קווי המתאר של mCherry (ציר y) לעומת FITC (ציר x) עוצמת הקרינה הוצגו לאוכלוסייה P1. שערי מלבניים הוצבו בקצה של autofluorescence של תאים כדי לבחור את P2 האוכלוסייה החיובי (FITC ו mCherry) ואת P3 האוכלוסייה השלילי. רמת הקרינה עבור tהוא התאים בתוך P2 באזור P3 היו דמיינו באמצעות תא עוקבות לספור לעומת עוצמת הקרינה FITC או mCherry היסטוגרמות חד פרמטר. הזזתי את עוצמת הקרינה על ציר ה- x y- ומספק מדד אמין של הביטוי הכולל קרום של Ca V α2δ1 בהתאמה. עוצמת אות הקרינה מגבירה כפונקציה של מספר מולקולות fluorochrome. (Ba) הנציג FCS / מגרשי נקודת SSC עבור כל תנאי כאמור. סך של 10,000 אירועים נרכשו לניתוח. שער האליפסה (P1) מופנה על ידי עין סביב תאי חיים בנטרול אירועים עם FSC הנמוכה (תאים מתים) או גבוהים SSC (אגרגטים). (Bb) מגרש קונטור שני פרמטר נציג של (ציר y) mCherry לעומת FITC (ציר x) עוצמת קרינה. גייטס הוצבו בקצה autofluorescence של התאים להפריד אוכלוסיות של תאים חיוביים FITC-mCherry (שער P2 ) ותאי פלורסנט שליליים (P3). (בי סי) יחיד-PArameter היסטוגרמות של ספירה יחסית (או% ממשקל מקסימאלי) תאים לעומת עוצמת קרינה (FITC או mCherry). חלוקת עוצמת הקרינה שנמדדה עבור תאים בתוך שער P2 (התאים חיוב קרינה) מוצגים אפורים, ואת חלוקת עוצמת קרינה עבור תאים הנמצאים שער P3 (תאים שלילי קרינה) מוצגת כשכבה בתוך עלילה אפורה שקופה. כפי שניתן לראות, את עוצמת הקרינה הייתה חזקה הוא mCherry ו FITC המציין כי Ca V α2δ1 מתבטא היטב ובהווה בבירור על קרום התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: מוטציות סימולטני של אתרי -glycosylation N שיבשו לשעבר פני התאpression של Ca V α2δ1. Stable TSA-201 Ca V תאים β3 היו transfected זמני במקביל pCMV-Ca V 1.2 WT ו pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT או מוטציות. -Permeabilized ללא (א) ותאי permeabilized (B) הוכתמו נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות כפי שתואר לעיל. מגרשים קווי המתאר של שני פרמטרים נציג של mCherry לעומת FITC הקרינה (פאנלים משמאל) היסטוגרמה מגרשים של חלוקת עוצמת הקרינה עבור מכתים נוגדן אנטי HA FITC מצומדות (לוחות מימין) מוצגים עבור מוטציות N -glycosylation (NQ) לאחר שיבוש של ארבעה אתרים (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) ו -16 אתרים (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) פנימה בשלמותו תאים שאינם permeabilized או NP (א) ו בתאים permeabilized או P (B). distribution של עוצמת הקרינה שנמדדה עבור תאים בתוך שער P2 (התאים חיוב קרינה) מוצגים אפורים, ואת חלוקת עוצמת קרינה עבור תאים הנמצאים שער P3 (תאים שלילי קרינה) מוצגת כשכבה בתוך שקוף עלילה אפורה. כפי שניתן לראות (B), רמות autofluorescence גברה לאחר התא permeabilization. עוצמת הקרינה עבור FITC נמדדה עבור כל תאי permeabilized טרנספקציה המוגברים (נתפסה משמרת ממש על ציר x) המציין כי כל חלבוני HA-tagged Ca V α2δ1 transfected היו מוכתמים זוהו על ידי הנוגדן אנטי HA FITC. (ג) גרף בר מציג את MFI המנורמל נמדד בנוכחות FITC פנימה בשלמותו-permeabilized הלא (ביטוי פני שטח) או תאי permeabilized (ביטוי כולל). צפיפות הקרינה היחסית נמדדה triplicates עבור כל תנאי (30,000 תאים) ובשלוש קבוצות שונות של תאי transfecטד על פני תקופה של חודש 1 ומכאן הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM עבור 90,000 תאים עבור כל תנאי. עוצמת קרינת השיא הושגה בין 24 ו -36 שעות לאחר transfection. ערכי ΔMFI עבור FITC נמדדים תאים שלמים-permeabilized הלא שמשו כמדד של הביטוי על פני קרום התא של Ca V α2δ1-HA, וערכי ΔMFI עבור FITC נמדדו בתאי permeabilized לשקף את ביטוי החלבון הכולל (פני תא ביטוי חלבון תאי ). ΔMFI עבור FITC חושב על ידי הפחתת עוצמת הקרינה FITC של תאים שלילי FITC (P3) מן עוצמת הקרינה של תאים חיוביים FITC (P2). השיטה זהה שימש לחישוב ΔMFI עבור mCherry. ערכי MFI היו מנורמלים לערך המקסימאלי שנמדד באותו היום עבור WT mCherry-Ca V α2δ1-HA. (ד) גרף בר מציג את mCherry ΔMFI המנורמל נמדד בתאים שאינם permeabilized או permeabilized (טוטאל הביטוי). תוצאות מבוטאות ממוצע ± SEM אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay cytometry מבוסס זרימה זו יושם בהצלחה על מדידת רמות פן כולל ותא היחסיים של fluorescently שכותרתו יוצרי הנקבוביות הקשורים יחידות המשנה של ערוצי סידן מגודר מתח 14,22,26. עדיף להשתמש כאשר חוקרים את ההשפעה של מוטציות גנטיות וכך מחייב כי עוצמת הקרינה הפנימית של המבנה fluorescently שכותרתו מתויג wild-type להיות לפחות 10 עד פי 100 גדול יותר עבור עוצמת הקרינה של לבנות מתויגות שכותרתו fluorescently . במקרה המסוים הזה, לבנות mCherry-Ca V α2δ1-HA המתואר כאן הניב אות גדולה יותר יחס רעש טווח דינמי גדול יותר ממה נמדד עבור ע"א שפורסם בעבר 1.2-HA ו- CA V 2.3-HA בונה. ישנן סיבות רבות על דעת לכך. זה יכול להיות שיערותיו כי הסביבה המקומית של epitope HA בתחום התאי של Ca V &# 945; 2δ1 חלבון ממקסם את יחס אות לרעש של הנוגדן FITC- מצומדות אנטי-HA.

בנוסף, חשוב לזכור כי שיטה זו אינה מספקת ערך מוחלט של מספר חלבונים על פני התא. הביטוי היחסי של המבנה המתויג נדרש לקבל ביטוי ערוץ פונקציונלי ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע הכתף אל-מהדק תיקון בצד וזרימת cytometry ניסויים באותם תנאים כפי שמוצגת באיור 7 הפניה 22. מנתונים אלו, ניתן לאמוד כי צפיפות זרם השיא, מידה גלובלית של פעילות ערוץ יון, מגדילה בדרך כלל כפונקציה של ביטוי המשטח של למקטע מתויג Ca V α2δ1. המגבלה העיקרית של assay ביטוי פני התא הנוכחי נותר שזה לא יכול להיות מיושם בשלב זה המחקר של תעלות יונים אנדוגני. זאת בשל העובדה כי כמה נוגדנים זמינים מסחריתידועים להיקשר חזה במיוחד בתחומים חיצוניים של תעלות יונים. לפיכך דורש מניפולציה גנטית של הרצף העיקרי של החלבון כדי להיחקר לידי ביטוי קו תאי רקומביננטי מובחן כגון תאי TSA-201.

צעדים קריטיים אופטימיזציה של assay: זיהוי הזוג המתאים של fluorophores, הבחירה של epitope החיצוני, ואת הלוקליזציה של הכניסה לאתר הם קריטיים להצלחת שיטה זו בגלל הכניסה של epitope לא אמורה להפריע תפקוד החלבון. שילובים fluorophore שונים נבדקו. שני אפיטופים חיצוניים: hemagglutinin (HA) epitope (YPYDVPDYA) ואת epitope bungarotoxin מחייב באתר (WRYYESSLEPYPD) 27 ושלושה נוגדנים מצומדות ניאון בלתי חדיר הוערכו, כלומר FITC (והעמסת isothiocyanate) -, R-Phycoerythrin -, ו נוגדני מצומדות PE-Cy7-. בנוסף, יותר מ -10 החדרה שונהאתרים עבור epitope HA החיצוני נבדקו בתוך V α2δ1 Ca. בהקשר יותר להחדרה של epitope הדורש mutagenesis באתר ביים וטכניקות DNA רקומביננטי, מומלץ לעצב מינימום של שלושה סטים של פריימרים בתוך אותו אזור. עם 9 שאריות, את epitope HA הוא אחד אפיטופים הקטנים עבורו קיים נוגדני ניאון מצומדות זמינים מסחרי אבל שיעור ההצלחה של החדרת 27 נוקלאוטידים הוא נמוך יותר מאשר מוטציה נקודתית. מוטיבי Tetracysteine (שאריות Cys-Cys-פרו-הגלאי-Cys-Cys) הן 2-שאריות קטנות יותר epitope HA אבל קלסר סיכת ראש arsenical וההעמסה הוא קרום permeant ולא מתאים לניתוח של חלבוני קרום נכנס 28. ניסויים ראשוניים נערכו עם שני fluorophores התאי mCherry וגרין פלורסנט חלבון (GFP). שלושה קריטריונים שימשו להפלות צמד מוצלח של fluorophores עם תעלות יונים: 1) ספקטרום הפליטה של ​​הצרכים fluorophoresלא חפיפה (ראה אזכור 20,21 לפרטים נוספים); 2) הביטוי של המבנה המתויג מייצר ערוץ יון פונקציונלי בתאי רקומביננטי כמו אומת על ידי שיטות אלקטרו סטנדרטיות; ו -3) הביטוי של המבנה השליט מייצר הודעת ניאון חזקה. אם לאחת מאמות מידה אלה אינה מתקיימת, למשל אם ההחדרה של תג או fluorophore מפריע פונקציה ערוץ, יש לחזור לנקודת ההתחלה ולשנות גם את האתר של החדרת epitope חיצוני ו / או הכניסה לאתר של fluorophore. מקשר של שאריות 5-גלוטמין בין מסוף C-של החלבון ואת fluorophore יכול לעזור לשפר את תפקוד החלבון. בנוסף, זה עשוי לעזור להכניס את epitope החיצוני בלולאות גדולות שאינם ידועים לשחק תפקיד קריטי בתפקוד חלבון ו / glycosylation חלבון. אחת גם צריך להיות מודע להיבטים טכניים קטין.

שיעור ההצלחה של transf בתיווך liposomeשיקוף בתאי TSA-201 יכול להיות ירידה לאחר החדרת שני אפיטופים בתוך Ca V α2δ1. לפיכך מוצע לכייל מחדש את יעילות transfection עם בונת DNA רומן. זה קורה כי ההחדרה של חלבון 30 kDa משנה את המשקל המולקולרי של ה- DNA. אפשר לשנות את ה- DNA יחס ליפוזומים ל -1: 2 ל -1: 3 במידת הצורך או דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה ארוכה יותר של זמן (24-72 שעות). חשוב לבחור את הניסוח הנכון permeabilizing התאים. רוב הפתרונות תוצרת בית המוערך עבור פרויקט זה התברר גורמים לתאים כדי לצבור ולסתום את זרימת cytometer.

בלימת חשיפה לאור בעוד מכתים את התא עם נוגדן מצומדות fluorophore חיוני להגביל photobleaching ואובדן אות. כדי למזער רקע פלורסנט, חשוב צנטריפוגות עודף נוגדן מצומדות לפני השימוש. לבסוף, זה הוא בעל החשיבות הרחוקה ביותר לנתח tהוא התאים על זרימת cytometer בהקדם האפשרי כפי ולא יאוחר מ -24 שעות לאחר. שמירה על התאים מוכתמים הלילה ב 4 ° C צפויות להפחית את האות ולפגוע הישרדות תא. וריאציות הקרינה הפנימית של הנוגדן fluorophore מצומדות מן אצווה אצווה להכתיב כי עוצמת הקרינה של מבנה המבחן צריך להיות מדווח כפונקציה של עוצמת הקרינה של מבנה השליטה לידי ביטוי בתנאים ניסיוניים זהים.

כדי להשיג אות טובה הכוללת יחס רעש, זה מומלץ להמעיט pipetting התא כדי להפחית מוות של תאים resuspend התאים בעדינות כזאת, כי 3 x 10 6 תאים / מ"ל מוזרקים cytometer את הזרימה. היזהרו, כי ריכוז התא גבוה יותר יקטין את זרימת התא יכול לסתום את זרימת cytometer. מצד השני, ריכוז תא תחתון ידרוש זמן עיבוד ארוך יותר. אפשר ולכן יש להתאים את הריכוז בהתאם tyPE של תאים להיות מנותח.

מבחנים אלטרנטיביים: מתודולוגיות נוספים פרוסים לתעד את הנוכחות של תעלות יונים כאשר נפל קרום פלזמת תא השטח בארבע קטגוריות גדולות: 1) שיטות הדמית Confocal ניצול אינטראקצית הזיקה הגבוהה בין נוגדני מצומדות fluorophore ואת חלבון המטרה; 2) טכניקות כימית חלבון נחות על השינוי קוולנטי של חלבון המטרה על ידי ריאגנטים biotinylation; 3) אמצעי אלקטרו של ניתוח רעש בלתי נייח; ו -4) תיוג Photoaffinity של חלבון המטרה עם בדיקות רדיואקטיבית. במקרה של תעלות סידן מגודרת מתח, תיוג photoaffinity עם tritiated (±) - [3 ח] PN 200-100, ליגנד גבוהה זיקה של משפחת dihydropyridine נעשה שימוש נרחב בשנת 1980 31. עד היום הוא assay רגישות גבוהה אך כרוך מניפולציה של חומר רדיואקטיבי 31, אשר נפל מן האופנה בעקבות כניסתושל היעילה בדיקות קרינת הארה רגישה במיוחד עם חוקרים צעירים. בנוסף, אי אפשר למדוד את פעילות ערוץ יון בנוכחות של אנטגוניסט, כך קורלציה בין ביטוי משטח ותפקוד הוא מעבר להיקף של גישה זו. בקצה השני של הרצף הניסיוני, ניתוח רעש בלתי נייח של תעלות יונים דורש הקלטות תיקון- clamp gigaseal באיכות גבוהה עם בסיס יציב להקלטות ארוכות דקות. עם גישה זו אפשר לחלץ את מספר תעלות יונים פתוחים בתא בודד מן המדרון של הגרפיקה התוויית השונה רעש כפונקציה של זרם הממוצע נמדד ב- שקבלו כל 32-34 פוטנציאליים. הוא מציג אותו סממני גישות אלקטרו סטנדרטיים. זהו עתירי עבודה ושיטה נמוכה תפוקה הדורש בנוסף היכרות טובה עם ניתוח ספקטרלי 32-34, לא מצרך של ביולוגים של תא. יתר על כן, זה סוג של לניתוחs מזהה את מספר תעלות יונים פעילים (במצב הפתוח) אשר עשוי להיות שונה ממספר חלבונים הכוללים על הממברנה. תיוג של חלבונים פני התא עם ריאגנטים ביוטין הוא כלי יעיל יחסית לזהות חלבונים נוכחים קרום הפלזמה. שיטה זו מנצלת את השינוי קוולנטי של חלבונים בממברנה ידי ביוטין וזיקה גבוהה עוד יותר גבוהה סגולי הלא הקוולנטי של ביוטין streptavidin קרום impermeant או מולקולות avidin. גישה זו היא איכותי אמינה אך נפגעת או להגבלה על פי נושאי כימותים הקשורים באופן קבוע עם חשיפת חלבונים באמצעות טכניקת הכתם המערבית. הדמיה Confocal ונגזרותיו נמצאים בשימוש נרחב על מנת לתעד את שיתוף לוקליזציה של חלבונים בממברנה עם פני התא 35. בידוד קרום הפלזמה איכותי נותר אפשרי תוך שימוש בטכניקות צנטריפוגה ההפרש עם או בלי שיפוע סוכרוז 36. כמו אסא cytometry הזרימה המתואר לעילy, היא מסתמכת על אינטראקציה ספציפית מאוד בין חלבון המטרה ואת נוגדן fluorophore מצומדות. הדמיה פנימי השתקפות קרינה סה"כ בפרט, היא גישה רבה עצמה שיכול לדווח על החלוקה והתנהגות מולקולרית של תעלות יונים יחידות על פני שטח קרום 37,38. את ההודעה היא בהחלט המושך את העין אבל נשארה גישה נמוכה תפוקה קטן-נפח. כל מבחנים אלה שיש הצטיינות המדעית שלהם. תזרים תפוקה גבוהה מבוססי cytometry assay עדיפה מבחינת שחזור ההודעה ומדדים לכימות אך דורש גישה קלה זרימה רב-לייזר cytometry הממיינים סלולריים, כי הם חלק המתקנים הליבה במוסדות גדולים. קרינה מבוססת קוראי צלחת זולים יותר נגישים אבל יחס האות לרעש הושגה נמדדת עם אותו בונה באותם תנאי הניסוי היה נמוך משמעותי נובעת במידה רבה על רקע קרינה גבוה. עלות של fluorophore מצומדותtibodies ניתן בחשבון גם ובעיקר בשל מספר ניסויי בקרה הנאותים שיש מעובד עם בונת המבחן. וריאציות על אותו הנושא כוללות שינוי נוגדן צבען מצומדות הניאון חסכוני-חזרת נוגדני כתב אנזים peroxidase או אלקליין פוספטאז אשר אנזים פעילות ניתן assayed ידי chemiluminescence 29,30.

מסקנה: מבחני קרינת שני צבעים פותחו כדי להעריך את הביטוי שטח פני התא היחסי של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים בתרבית באמצעות cytometers זרימה. אמנם רק שני פרמטרים פלורסנט שמשו assay הנוכחית, cytometry זרימה ניתן לגילוי סימולטני של יותר מ -30 בדיקות ניאון על תא בודד, הממחישה את הגמישות הגבוהה של גישה זו. Assay רגישה תפוקה גבוהה זו ניתן להתאים לחקור את ההשפעה של מוטציות גנטיות 22,26 או modificati posttranslational23 תוספות, כמו גם לימוד פרופיל פרמקולוגי של המלוות של סחר השטח של טכניקות חלבונים בממברנה 39. הדחף מאחורי פרוטוקול זה נבע מהצורך להעריך בבידוד ההשפעה של מוטציות גנטיות על הביטוי הממברנה של תעלות יונים בתאי רקומביננטי. זה אולם חשוב לציין כי חומרת תפקוד ערוץ מוטציה בשורות תאי המודל אינו תמיד לתאם עם חומרת הסימפטומים הקליניים בנשאיות המוטציה 5 בין השאר משום שילוב של מוטציות אללים שונים ייתכן שתידרש להפעיל למוות קרדיאלי פתאומי 40 , 41. בהקשר זה, assay זה ניתן לראות מתן קירוב ראשון-צעד מהיר של לימוד מוטציות בודדות או מרובות בגן בודד הקשורים למוטציות הפסד של פונקציה 22. זה אולם סביר לחזות בעתיד את הביטוי בתיווך וירוס מאותו הבונה בתאי בדיל של cardiomyocyשושלת te. בסך הכל, לעומת שיטות הדמיה או זורח אחרות, לזרום cytometer הממיין לטפל בתאי חיים בעוצמת קרינת השעיה ודוח של אוכלוסיית תא הומוגנית. תהליך זה נעשה ללא צורך קיבעון עם paraformaldehyde, תהליך שגורם permeabilization קרום הפלזמה המקומי, אפילו בתנאים קלים 42. Assay הוא מהיר, ספציפי, ונוח עם הניתוח של עד כמה מאות דגימות ליום עבודה. בנוסף ניתוח, התאים עשויים להיות מסודר בסופו של דבר על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את הפוטנציאל התפקודי של תאים המבטאים רמות גבוהות או נמוכות של אותו חלבון הממברנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 115 ערוצי סידן ביטוי חלבון פני תא ביטוי חלבון תאי ביטוי רקומביננטי cytometry זרימה
קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bourdin, B., Segura, E.,… More

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter