培养人骨髓间充质基质细胞(hMSCs)与自体血清,降低排斥异种材料等负面影响的风险。它也允许对中胚层祖细胞的子集,这可以提供新鲜的hMSCs的恢复。在自体纤维蛋白凝块嵌入的hMSCs可轻松处理和有效的手术植入。
人类间充质基质细胞(hMSC)的培养是在与不同的介质体外培养。他们在临床环境中的使用限制,但主要依赖于异种养分他们的文化产生潜在的生物危害和炎症的风险。人的衍生物或重组材料是第一志愿考生,以减少这些反应。因此,培养补充剂和自体来源的材料代表了最好的营养物质和最安全的产品。
在这里,我们描述了用于分离和骨髓的hMSCs培养新的协议在自体的条件 – 即源自患者的血清作为培养基和纤维蛋白作为的hMSC给药的脚手架补充。事实上,修复hMSC /纤维蛋白凝块结构可能有多种临床应用极为有用。特别是,我们专注于自己的矫形外科使用,在允许的情况从捐赠者的自己的血源性纤维蛋白凝块有效的细胞输送养分/废物交换。为了确保最佳的安全条件下,它是极为重要的,以避免的hMSC转化和组织过度生长的风险。由于这些原因,在本文中所描述的方法也指示一个最小体外的hMSC扩张,以减少细胞衰老和形态学变化,和短期骨分化植入前,以诱导成骨谱系说明书中,从而减少随后的不受控制的风险增殖。
人类间充质基质细胞(hMSC)的培养表示的用于组织工程应用的最佳小区的来源之一是促进成骨1,2。它们很容易地从骨髓和其他成人组织中分离,并表达典型的表面标记如CD90,CD105,CD73 1。此外,它们可以分化成多种细胞类型,如成骨细胞,软骨细胞和脂肪细胞3。其治疗效果归因于他们的再生和营养特性4。的hMSCs可以在整形外科手术中使用,以及在其它的再生临床应用。它们优选与支架相结合,以提高临床结果5。
与其它材料相比,纤维蛋白凝胶显示令人感兴趣的性质,如粘合性,吸收和营养物,这使得它适用于各种组织工程应用6,7-极为有用的高效率的运输。
<p c小姑娘="“jove_content”">在翻译的组织工程方法进入临床应用中得到一个完全生物相容和生物安全支架和可避免任何感染或反应性效果的无异物培养基中的主要挑战。在我们的方法中,纤维蛋白胶,从患者自身的血液来源,自体血清, 用于体外的hMSCs培养,被用作在矫形场8一个可能的治疗方案。
用于临床目的,的hMSCs通常通过两种主要的方法施用:(i)该“一步法”的过程( 即 ,最小的操作),它允许骨髓的自动移植,无论是整体或浓缩( 即 ,单核细胞),在手术过程中;及(ii)中的“两步”的过程( 即,大量的操作),它是基于的hMSCs的体外扩增以增加植入前的产量,并且需要ģMP设施9。有趣的是,用人类成人血清代替小牛血清培养细胞允许回收,用的hMSCs一起,将细胞的一个子集(1 -单核培养物的10%)被称为中胚层祖细胞器(MPC),能够在体外分化成新鲜的hMSCs 10,11。因此,hMPCs可能当单独12,13的hMSCs相比起到再生过程一个显著的作用。最后,短期骨诱导推的hMSCs开始它们分化成成骨谱系而不丧失其增殖潜能和生存能力12。这些结果证实,已经报道增强体内骨形成通过的hMSCs先前的研究,随后在成骨培养基中14预培养物。而且,自体血浆凝块作为用于细胞递送的支架可容易地由外科医生操纵和成形,以适应骨腔13的形状。
钍erefore,这种方法可以为那些研究人员和临床谁瞄准从替补翻译其基于的hMSC疗法在整形外科应用床边极为有用。
此协议关注的关键步骤使用成人血清和蛋白酶,允许获得生物安全hMSC的治疗。特别是,人的成人血清使得隔离和维护,而蛋白酶确保的MPC的收成。这些存在于骨髓中,可以以新鲜的hMSCs产生,从而保证沿着培养时间可行的hMSCs的储未成熟细胞。不是所有的的MPC可以收集,因为增加曝光时间来蛋白酶活性是有害的hMSC生存能力。出于这个原因,一个10分钟的蛋白酶孵育被选为的MPC的回收和的hMSCs的生存能力之间的最佳折衷。另一个关键步骤是osteodifferentiation时间。事实上,广泛的体外 osteodifferentiation将大大降低细胞活力,从而影响体内最终的骨形成。最后关键的一步在于自体生物可吸收支架援用,which的通过在从血浆凝固纤维蛋白凝胶包埋细胞(hMSCs和的MPC)中获得。
一个关键的步骤,以提高的MPC的产率在较高的浓度播种单核细胞。使用单采程序得到血浆和葡萄糖酸钙处理它使得有可能在大量达到自体血清。已经观察到,人血清作为介质补充相当于胎牛血清(FBS)中的hMSC培养物。然而,在我们的经验,辅以FBS的完全培养基有利于比成人快血清衰老。一个显著的步骤是给予最小的骨诱导到的hMSCs。事实上,这种处理导致细胞容易地朝向成骨谱系分化,因此是为了避免在体内进一步细胞转化中有用。为了维持最低限度osteoinduced的hMSCs良好的生存能力,建议仔细按照步骤6.5中所述的建议。一个Ð8.2,包括处理,离心和介质的量被添加。如果分离性输血过程不可用,仍然有可能通过执行多个抽血到患者,或在替代方案中,通过购买汇集AB血清来进行此协议。显然,为了从替补到床边带来这个协议中,它是强制性的,以具有GMP细胞工厂,或等同物,购。
限制这种技术关注贫血,血液肿瘤内科和骨科病人受骨髓炎的应用程序,绘制了大量的来自贫血患者血液中,应尽量避免。在肿瘤学的患者中,细胞样品的质量是通过化疗的影响,而在骨髓炎患者感染可影响最终结果。在所有在其中自体血清不足或不适合的情况下,汇集男性AB血清代表一个很好的选择。
使用Cell /纤维蛋白CLO对于可能的临床应用吨构建体是释放完全自体细胞治疗,这可能是很容易在手术过程中,以处理和模具,导致极好的结果来治疗骨非工会13是至关重要的。最小的操作和丰富的操作9:临床目的,是的hMSCs通常通过两种主要的程序管理。为了克服有关的广泛的体外培养物中的问题,如在细胞形态和大小18异常,我们进行了很短的时间离体细胞扩增和骨的分化(仅4天)。
本文与短信元扩张和osteodifferentiation倍描述一起自由异种协议,证明是在为了获得快速骨生产体内诊所相关,没有组织过度生长和转化的证据,从而证实其有效性和长在骨修复-term安全(图5) </stroNG> 13。
本报告中提出的方法的目的是证明,在用于在整形外科手术可能使用自体的条件体外扩增的hMSC的疗效和安全性。该协议采用从骨髓并培养在补充有自体血清和嵌入式自体血纤维蛋白凝块,从而确保了完全自体细胞治疗的培养基中分离的hMSCs。两折骨诱导,就在第二支队之前,提高hMSC的分化为成骨细胞的能力。其结果是,该技术特别适用于骨缺损的应用,因为它并不限于假关节。未来可能的应用可能涉及距骨囊肿和骨损管理。
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |