otolog serum ile insan Mezenkimal Stromal Hücreleri (hMSCs) Kültürleme, ksenojenik malzeme ve diğer olumsuz etkileri ile reddi riskini azaltır. Aynı zamanda, taze hMSCs sağlayabilir mezodermal progenitörlerin bir alt kümesi, bir geri kazanımını sağlar. otolog fibrin pıhtısı içinde hMSCs gömülmesi kolay kullanım ve etkin bir cerrahi implantasyon sağlar.
Insan mezenkimal stromal hücreler (hMSCs) farklı bir ortam ile in vitro olarak kültürlenir. klinik ortamlarda kullanımları Sınırları Ancak, esas olarak kendi kültürü için ksenojenik besin tarafından uygulanan potansiyel biyolojik tehlike ve inflamasyon riskleri bağlıdır. İnsan türevleri veya rekombinant malzemeler bu tepkileri azaltmak için ilk tercihi adaylarıdır. Bu nedenle, kültür takviyeleri ve otolog kökenli malzemeler en iyi besin ve güvenli ürünlerini temsil eder.
Burada, otolog koşullarda izolasyonu ve kemik iliği hMSCs kültür için yeni bir protokol açıklar – yani, bir hastada elde edilen serum hMSC uygulama için bir iskele olarak kültür ortamı ve fibrin için bir ek olarak. Nitekim, hMSC / fibrin pıhtı yapıları çeşitli klinik uygulamalar için son derece yararlı olabilir. Özellikle, donörün kendi kanından elde edilen fibrin pıhtı izin ortopedik cerrahi kullanımları, odaklanmakEtkili hücre teslimat ve besin / atık alışverişi. Optimum güvenlik koşullarını sağlamak için, hMSC dönüşüm ve doku üremesine risklerini önlemek için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenlerden dolayı, bu makalede açıklanan yaklaşım ayrıca, böylece daha sonraki kontrolsüz riskini azaltarak, implantasyon öncesi hücre yaşlanması ve morfolojik değişiklikler ve kısa süreli osteo-farklılaşma azaltmak için osteojenik soy özellikleri ikna etmek için, minimal ex vivo hMSC genişleme gösterir çoğalma.
İnsan mezenkimal Stromal hücreler (hMSCs) osteogenesisi 1,2 teşvik etmek için doku mühendisliğinde kullanım için en iyi cep kaynaklarından birini temsil etmektedir. Kolayca, kemik iliği ve diğer yetişkin dokulardan izole edilir ve örneğin CD90, CD105, CD73 1 tipik yüzey belirteçleri ifade edilir. Ayrıca, bu tür osteoblastlar, kondrositler ve adipositler 3 gibi çeşitli hücre tipleri, dönüşebilirler. Onların tedavi edici etkileri kendi rejeneratif ve trofik özellikleri 4 atfedilir. hMSCs diğer yenileme klinik uygulamalarda olduğu gibi, ortopedik cerrahide yaygın olarak kullanılabilir. Bunlar tercihen klinik sonuçlar 5 geliştirmek için iskeleler ile birleştirilir.
Diğer malzemelere kıyasla, fibrin jel gibi yapışma, rezorpsiyon ve doku mühendisliği uygulamaları 6,7 çeşitli son derece kullanışlı hale besinlerin verimli ulaşım gibi ilginç özellikler gösteriyor.
<p class = "jove_content"> tam biyouyumlu ve Güvenli bir iskele ve herhangi bir enfektif veya reaktif etkisi kaçınan bir xeno içermeyen kültür ortamı elde edilmesidir klinik uygulamalar içine bir doku mühendisliği yaklaşımı çeviri temel zorluk.Hastanın kendi kanından elde edilen bir yöntem, fibrin jel, ve otolog serum, in vitro hMSCs kültürü için, ortopedik alanda 8 olası bir tedavi solüsyon olarak kullanıldı.
Klinik amaçlar için, hMSCs genellikle iki ana prosedürlerle uygulandı: (i) ya da bütün ya da (yani mononükleer hücreler) konsantre edildi, kemik iliği nakli, otomatik sağlayan "tek aşamalı" yöntemi (yani, en az manipülasyon), ameliyat sırasında, ve (ii) implantasyon öncesi kendi verimini arttırmak için hMSCs ex vivo genişlemesi dayanmaktadır "iki aşamalı" prosedürü (yani, geniş manipülasyon), ve G gerektirirMP tesisleri 9. Taze olarak in vitro farklılaşabilen, – (tek çekirdekli kültürlerinde% 10 1) olarak adlandırılan Mezodermal progenitör hücrelerinin (MPCs) İlginç bir şekilde, yerine buzağı serumu insan yetişkin serumu ile kültür hücreleri, hücrelerin bir alt kümesinin, bir araya hMSCs ile iyileşme sağlar hMSCs 10,11. Bu nedenle, hMPCs hMSCs başına 12,13 ile karşılaştırıldığında rejeneratif sürecinde önemli bir rol oynayabilir. Son olarak, kısa süreli osteo-indüksiyon potansiyeli kendi proliferatif kaybetme ve 12 canlılığı olmaksızın osteojenik soy içine farklılaşma başlatmak için hMSCs iter. Bu sonuçlar osteojenik ortamda 14 bir ön kültür izledi hMSCs tarafından in vivo kemik oluşumunda geliştirilmiş bildirdin önceki çalışmaları, onaylayın. Ayrıca, hücre dağıtımı için bir iskele olarak otolog plazma pıhtısı kolayca cerrah tarafından manipule ve kemik boşluğu 13 şekline uyacak şekilde kalıplanabilir.
therefore, bu yöntem ortopedik uygulamalarda hasta yatağına tezgah kendi hMSC bazlı tedavi çeviri amaçlayan bu araştırmacılar ve klinisyenler için son derece yararlı olabilir.
Bu protokol, ilgi kritik adım Güvenli bir hMSC tedavi elde etmek için izin insan yetişkin serumu ve proteaz kullanımı. proteaz MPCs, hasat sağlar iken, özellikle insan yetişkin serumu, izolasyon ve bakım sağlar. Bu nedenle, kültür süresi boyunca uygun bir hMSCs bir rezervuar temin taze hMSCs ortaya çıkmasına neden olabilir, kemik iliğinde bulunan olgunlaşmamış hücrelerdir. proteaz aktivitesine pozlama süresini artırarak hMSC canlılığı için zararlı olduğundan değil, tüm PPM'ler toplanabilir. Bu nedenle, 10 dakika proteaz inkübasyon MPCs kurtarma ve hMSCs canlılığı arasında optimum uzlaşma olarak seçildi. Diğer önemli adım osteodifferentiation zamanıdır. Nitekim, in vitro osteodifferentiation geniş bir ölçüde böylece in vivo olarak nihai kemik oluşumunu etkileyen, hücre canlılığı azaltacaktır. son kritik adım bir otolog biorezorbabl iskele availing oluşur, yüklenebileceğiniH, plazma pıhtılaşma Bir fibrin jel hücreleri (hMSCs ve MPCs) gömme ile elde edilir.
MPCs verimini arttırmak için bir anahtar aşama, daha yüksek bir konsantrasyonda mononükleer hücreleri tohum etmektir. plazma elde etmek için aferez prosedürler kullanılarak ve kalsiyum glukonat ile muamele ile de büyük miktarlarda, otolog serum elde etmeyi mümkün kılar. Bir orta ek olarak insan serum hMSC kültürlerinde fetal sığır serumu (FBS) ile karşılaştırılabilir olduğu görülmüştür. Ancak, bizim deneyim, FBS ile takviye tam orta insan yetişkin serumu daha hızlı yaşlanma katkıda bulunur. Önemli bir adım olduğunu hMSCs bir asgari osteoindüksiyonu tatbik etmektedir. Gerçekten de bu tedavi ve böylece in vivo olarak daha fazla hücre dönüşümü önlemek için yararlı olan, kolay osteojenik soy doğru ayırt etmek için hücreleri neden olur. minimal osteoinduced hMSCs iyi canlılığını korumak için, dikkatli adımlarla 6.5 açıklanan önerileri takip önerilir. bird 8.2., taşıma, santrifüj ve orta miktarlarda dahil eklenecek. Bir aferez işlemi mevcut değilse, havuza AB sera satın alarak, alternatif olarak, hastaya berabere ya da birden fazla kan gerçekleştirerek bu protokolü yürütmek mümkündür. Açıkçası, tezgah arası başucunda bu protokolü getirmek için, mevcut GMP hücre fabrikaları veya eşdeğerleri olması zorunludur.
Osteomiyelit etkilenen bu tekniğin endişe anemik, hematolojik onkoloji ve ortopedi hastalarının uygulamaya Sınırlamalar., anemik hastaların büyük miktarda kan Çizim, kaçınılmalıdır. osteomiyelit hastalarında enfeksiyon nihai sonucunu etkileyebilecek ise onkolojik hastalarda, hücre örneklerinin kalitesi, kemoterapi tedavileri etkilenir. otolog serum yetersiz veya uygun olmayan olduğu tüm durumlarda, toplanmış erkek AB sera iyi bir alternatif oluşturmaktadır.
Hücre / fibrin clo kullanarakMümkün klinik uygulamalar için t yapıları kemik olmayan sendikalar 13 tedavi etmek için mükemmel sonuçlar sonuçlanan ameliyat sırasında ele almak ve kalıp kolay olabilir tamamen otolog hücre tedavisi, serbest bırakmak için önemlidir. Az manipülasyon ve detaylı manipülasyon 9: klinik amaçlar için, hMSCs genellikle iki ana prosedürlerle uygulanır. Bu, hücre morfolojisi ve boyutu 18 anormallikler olarak geniş ex vivo kültür ile ilgili problemleri aşmak için, ex vivo hücre genişlemesi ve osteo-farklılaşma (sadece 4 gün) kısa bir kez gerçekleştirilir.
Gösterdi kısa hücre genişlemesi ve osteodifferentiation süreleri ile birlikte, bu yazıda anlatılan xeno ücretsiz protokol, doku üremesine ve dönüşüm delil olmaksızın, in vivo olarak hızlı kemik üretimi elde etmek için kliniklerde ilgili olduğu, bu nedenle teyit etkinliği ve uzun kemik tamir uzun dönem güvenlik (Şekil 5) </strong> 13.
Bu raporda sunulan metodoloji ortopedik cerrahide olası kullanım için otolog koşullarda in vitro genişlemesi hMSC etkinliğini ve güvenilirliğini gösteren hedefleniyor. Bu protokol, ortam otolog serumu ile desteklenmiş ve bu nedenle tamamen otolog hücre tedavisi sağlanması otolog fibrin pıhtısı gömülü kemik iliği ve kültürlenmiş izole hMSCs kullanmaktadır. iki kat osteojenik indüksiyon, sadece ikinci dekolmanı önce, osteoblast içine ayırt etmek hMSC yeteneğini geliştirir. Bu psödoartrozu sınırlı değildir, çünkü, bir sonuç olarak, bu teknik, kemik defektlerinin uygulamalar için özellikle uygundur. Gelecekteki olası uygulamalar talus kist ve kemik kaybı yönetimini içerebilir.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |