Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.
Menselijke mesenchymale stromacellen (hMSCs) in vitro worden gekweekt met verschillende media. Beperkingen op het gebruik ervan in klinische settings, echter vooral afhangen van potentieel biologisch en ontsteking risico's die wordt uitgeoefend door xenogene voedingsstoffen voor hun cultuur. Menselijke derivaten of recombinante materialen zijn de eerste keuze kandidaten om deze reacties te verminderen. Daarom cultuur supplementen en materialen van autologe herkomst vertegenwoordigen de beste voedingsstoffen en de veiligste producten.
Hier beschrijven we een nieuw protocol voor de isolatie en kweek van beenmerg hMSCs in autologe omstandigheden – namelijk patiënt afgeleid serum als een supplement voor het kweekmedium en fibrine als een matrix voor hMSC toediening. Inderdaad zouden hMSC / fibrinestolsel constructen zeer nuttig voor verschillende klinische toepassingen. In het bijzonder richten we ons op het gebruik ervan in de orthopedische chirurgie, waar de fibrinestolsel afgeleid van eigen bloed van de donor toegestaaneffectieve cel levering en voedingsstoffen / afval uitwisselingen. Om te zorgen voor een optimale veiligheid, is het van het grootste belang om de risico's van hMSC transformatie en weefsel wildgroei te voorkomen. Daarom is de aanpak beschreven in dit document geeft ook een minimaal ex vivo hMSC expansie naar cel senescentie en morfologische veranderingen, en korte termijn osteo-differentiatie te verminderen vóór implantatie osteogene lineage specificatie induceren, waardoor het risico van latere ongecontroleerde afnemende proliferatie.
Menselijke mesenchymale stromacellen (hMSCs) vormen een van de beste bronnen van cellen voor gebruik in weefselmanipulatie voor het bevorderen van osteogenese 1,2. Ze zijn gemakkelijk geïsoleerd uit het beenmerg en andere volwassen weefsels en een automatische typische oppervlak markers zoals CD90, CD105, CD73 1. Bovendien kunnen ze differentiëren in verschillende celtypes, zoals osteoblasten, chondrocyten en adipocyten 3. Hun therapeutische effecten worden toegeschreven aan hun regeneratieve en trofische eigenschappen 4. hMSCs kunnen worden gebruikt in orthopedische chirurgie, en in andere regeneratieve klinische toepassingen. Ze worden bij voorkeur gecombineerd met steigers, het klinische resultaat 5 verbeteren.
In vergelijking met andere materialen, de fibrine gel toont interessante eigenschappen zoals hechting, resorptie en efficiënte transport van voedingsstoffen, waardoor het zeer nuttig zijn voor allerlei toepassingen van weefselmanipulatie 6,7 maken.
<p class = "jove_content"> De belangrijkste uitdaging in het vertalen van een tissue engineering aanpak in klinische toepassingen is het verkrijgen van een volledig biocompatibel en BIOSAFE steiger en een xeno-vrije cultuur medium dat een infectieuze of reactief effect vermijdt.Bij onze werkwijze, fibrine gel, verkregen uit bloed van de patiënt en autoloog serum, in vitro hMSCs kweek werden gebruikt als een mogelijke therapeutische oplossing in de orthopedie 8.
Voor klinische doeleinden worden hMSCs meestal toegediend via twee procedures: (i) het "eenstaps" procedure (dat wil zeggen, minimale manipulatie), waarbij de automatische transplantatie van beenmerg maakt het gehele of geconcentreerd (bijvoorbeeld, mononucleaire cellen), tijdens de operatie; en (ii) de "tweestaps" procedure (dwz uitgebreide manipulatie), die is gebaseerd op de ex vivo expansie van hMSCs om hun rendement te verhogen voor implantatie en vereist GMP faciliteiten 9. Interessant kweken van cellen met humaan volwassen serum in plaats van runderkalfserum maakt de terugwinning, met hMSCs van een subset van cellen (1-10% in mononucleaire kweken) genoemd mesodermale progenitorcellen (MPL), kunnen in vitro differentiatie in verse hMSCs 10,11. Aldus kan hMPCs een belangrijke rol in het regeneratieve proces speelt vergelijking met alleen 12,13 hMSCs. Tot slot, op korte termijn osteo-inductie duwt hMSCs om hun differentiatie in de osteogene lineage te starten zonder verlies van hun proliferatieve potentieel en de levensvatbaarheid 12. Deze resultaten bevestigen eerdere studies die hebben gerapporteerd verbeterde in vivo botvorming door hMSCs, gevolgd door een voorkweek in osteogene medium 14. Bovendien kan een autoloog plasma stolsel als matrix voor cel levering gemakkelijk worden gemanipuleerd door de chirurg en gevormd tot de vorm van het bot holte 13 past.
therefore deze werkwijze kunnen zeer nuttig zijn voor de onderzoekers en clinici die tot doel hebben de hMSC-gebaseerde therapie vertalen van de bank om het bed in orthopedische toepassingen.
De kritische stappen van dit protocol betreffen het gebruik van menselijke volwassen serum en protease, die het mogelijk maken om een BIOSAFE hMSC therapie te verkrijgen. Vooral de volwassen mens serum maakt isolatie en onderhoud, terwijl protease zorgt de oogst van MTR. Deze onrijpe cellen aanwezig in het beenmerg die aanleiding kunnen geven tot nieuwe hMSCs, waardoor een reservoir van levensvatbare hMSCs langs de kweekperiode. Niet alle MPL worden verzameld, omdat het verhogen van de belichtingstijd voor de protease activiteit schadelijk voor hMSC levensvatbaarheid. Daarom werd een 10 min incubatie protease gekozen als optimaal compromis tussen het herstel van MTR en levensvatbaarheid van hMSCs. Een andere belangrijke stap is osteodifferentiation tijd. Inderdaad, een uitgebreide in vitro osteodifferentiation aanzienlijk zou verminderen levensvatbaarheid van de cellen, waardoor de uiteindelijke botvorming in vivo beïnvloeden. De laatste cruciale stap bestaat uit het gebruikmaken van een autologe bioresorbeerbaar schavot which wordt verkregen door het inbedden van de cellen (hMSCs en MPL) in een fibrine gel van plasma stolt.
Een belangrijke stap om de opbrengst van MPL te verbeteren is om mononucleaire cellen zaad bij hogere concentraties. Afereseprocedures gebruikt om plasma te verkrijgen en behandelen met calciumgluconaat maakt het mogelijk autoloog serum verwezenlijken in grote hoeveelheden. Het is waargenomen dat humaan serum als een mediumsupplement vergelijkbaar met foetaal runderserum (FBS) in hMSC culturen. Echter, in onze ervaring, een compleet medium aangevuld met FBS draagt bij aan een snellere veroudering dan volwassen mens serum. Een belangrijke stap is dat het toedienen van een minimale osteoinductie om hMSCs. Inderdaad, deze behandeling leidt de cellen eenvoudig te differentiëren tot de osteogene lineage, dat is handig verdere celtransformatie in vivo voorkomen. Om een goede levensvatbaarheid van minimaal osteoinduced hMSCs te handhaven, is het raadzaam om voorzichtig de in stappen 6.5 beschreven aanbevelingen op te volgen. eend 8.2., onder andere bij hantering, centrifugeren en middelgrote bedragen die moeten worden toegevoegd. Als een aferese procedure niet beschikbaar is, is het toch mogelijk dit protocol worden uitgevoerd vóór het uitvoeren van meerdere bloedafnames voor de patiënt of, subsidiair, door de aankoop van samengevoegde sera AB. Uiteraard, om dit protocol van de bank naar bed te brengen, is het verplicht om GMP celfabrieken of equivalenten beschikbaar.
Beperkingen betreffende de toepassing van deze techniek betreffen de bloedarmoede, hematologische-oncologie en orthopedische patiënten die lijden aan osteomyelitis., Tekening grote hoeveelheden bloed van anemische patiënten, moeten worden vermeden. Oncologische patiënten is de kwaliteit van de celmonsters die door chemotherapie behandelingen, terwijl bij osteomyelitis patiënten de infectie kan het eindresultaat beïnvloeden. In alle gevallen waarin de autoloog serum onvoldoende of ongeschikte, samengevoegde mannelijke AB sera vormen een goed alternatief.
Met behulp van mobiele / fibrine clot constructen voor eventuele klinische toepassingen is cruciaal voor een volledig autologe celtherapie, die gemakkelijk te hanteren en matrijs tijdens de operatie kan staan, zodat uitstekende resultaten op het bot non-unions 13 behandelen vrijgeven. Voor klinische doeleinden worden hMSCs meestal toegediend via twee procedures: minimaal manipulatie en uitgebreide manipulatie 9. Om de problemen in verband met een uitgebreide ex vivo kweken zoals afwijkingen in celmorfologie en maat 18 te overwinnen, hebben we een kort ex vivo celexpansie en osteo-differentiatie (slechts 4 d).
De xeno-vrije protocol beschreven in dit document, samen met de korte celexpansie en osteodifferentiation keer aangetoond relevant klinieken om snel botaanmaak in vivo te verkrijgen, zonder bewijs weefsel overgroei en transformatie, hetgeen bevestigt de werkzaamheid en lange -term veiligheid botherstel (figuur 5) </strong> 13.
De in dit rapport gepresenteerde methode is gericht op het aantonen van de werkzaamheid en veiligheid van hMSC in vitro expansie in autologe voorwaarden voor eventueel gebruik bij orthopedische chirurgie. Dit protocol maakt gebruik hMSCs geïsoleerd uit beenmerg en gekweekt in een medium aangevuld met autoloog serum en ingebed in autologe fibrine stolsel, waardoor een volledig autologe celtherapie. De tweevoudige osteogene inductie, net voor de tweede onthechting, verbetert hMSC vermogen om te differentiëren in osteoblasten. Daardoor is deze techniek bijzonder geschikt voor toepassingen in botdefecten, aangezien het niet beperkt tot pseudartrose. Mogelijke toekomstige toepassingen kunnen talus cyste en botverlies het management te betrekken.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |