Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Summary

Этот метод демонстрирует эффективный способ подготовки к репликации дефектной ретровирусных запасов кодирования человека онкоген, а в дальнейшем использоваться для индукции миелопролиферативные заболевания в мышиной модели.

Abstract

Наша лаборатория изучает человеческое миелопролиферативных заболеваний, вызванных такими как онкогены Bcr-Abl или фактор роста рецептора полученных онкогенов (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα и т.д.). Мы можем моделировать и изучать человека-подобного заболевания у нашей модели мыши, путем пересадки клеток костного мозга ранее инфицированы ретровирусом выражения онкоген интересов. Репликация-дефектных ретровируса кодирования человеческих онкогенов и маркера (GFP, ППП, ген устойчивости к антибиотику, и т.д.) производится переходных протокол трансфекции с использованием 293T клеток человеческого эпителия почечных клеточной линии преобразуется продукт гена E1A аденовирусов. 293 клетки обладают необычным свойством высокой степени transfectable кальция фосфата (КАПО _4), до 50-80% эффективности трансфекции легко достижима. Здесь мы сотрудничаем трансфекции клеток 293 с ретровирусных вектор выражения онкоген интересов и плазмиды, что выражает кляп-пол-ENV упаковки функций, таких как одного генома упаковки строит кат или PCL, в данном случае EcoPak плазмиды. Начальная трансфекции является дальнейшее совершенствование использования хлорохину. Запасы ecotropic вируса, собранная, как культура супернатанта 48 часов. после трансфекции, можно хранить при температуре -80 ° С и использовали для заражения клеточных линий с учетом трансформации и в лабораторных исследованиях, или первичные клетки, такие как мышиные клетки костного мозга, которые затем могут быть использованы для трансплантации в нашей модели мыши .

Protocol

Вечером перед преобразованием, пластины 293T клетки в 3-5х10 6 кл / 6 см cultureplate ткани. Примечание: Мы используем клетки 293T за их простоту трансфекции и efficacyas вирусом клеток. Эти клетки являются несовершенными в упаковке вирус, если вспомогательную плазмиду вводят. Перво?…

Discussion

Четыре критических точек будет гарантировать успех хорошего вирусного складе:

1. 293T продуцирующие клетки должны быть очень здоровым, то есть они были разделены на очень регулярно, никогда не были заросшие, и высевают на оптимизированные плотностью 3,5-5 млн в 6 см планшета для культуры ткани…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.