La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Summary

Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.

Abstract

Nuestros estudios de laboratorio de las enfermedades mieloproliferativas humanos inducida por oncogenes como Bcr-Abl o receptor del factor de crecimiento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR, etc.) Somos capaces de modelar y estudiar una enfermedad parecida a la humana en nuestro modelo de ratón, mediante el trasplante de células de médula ósea previamente infectadas con un retrovirus que expresan el oncogén de interés. Replicación defectuosa retrovirus que codifica para un oncogén humano y un marcador (GFP, RFP, gen de resistencia a antibióticos, etc) es producido por un protocolo de transfección transitoria con células 293T, un ser humano línea de células epiteliales renales transformado por el producto del gen E1A de adenovirus. 293 células tienen la extraña propiedad de ser altamente transfectable por fosfato de calcio (Capo _4), con hasta un 50-80% la eficiencia de transfección puede lograrse fácilmente. En este sentido, co-transfectar 293 células con un vector retroviral que expresan el oncogén de interés y un plásmido que expresa las funciones de embalaje gag-pol-env, como por ejemplo el genoma de un solo embalaje construye kat o PCL, en este caso el Ecopak plásmido. La transfección inicial se mejora aún más mediante el uso de la cloroquina. Las existencias de virus ecotropic, recogidos como sobrenadante de cultivo de 48 horas. después de la transfección, se pueden almacenar a -80 ° C y se utiliza para la infección de líneas celulares a la vista de la transformación y en estudios in vitro, las células primarias o como las células de médula ósea de ratón, que luego pueden ser utilizados para el trasplante en nuestro modelo de ratón .

Protocol

La noche antes de la transformación de células de placas, 293T en 3-5×10 6 células / 6 cultureplate tejido cm. Nota: Usamos células 293T por su facilidad de transfección y virus productores de células efficacyas. Estas células son deficientes en el embalaje del virus a menos que un plásmido auxiliar que se introduce. La primera mañana, retire suavemente medio y reemplazar con 4 ml de células 293T medicina que contiene 25 mM cloroquina. Puesto en la incubadora durante 1 …

Discussion

Cuatro puntos críticos que aseguran el éxito de una acción viral buena:

1. Las células 293T produce tiene que ser muy saludable, lo que significa que se han dividido en un horario muy regular, nunca fueron crecido, y se colocan en la densidad óptima de 3,5 a 5.000.000 por 6 cm de la placa de cultivo de tejidos, por lo que llegar a una densidad del 80% de la placa en la mañana de la transfección.
   
2. Además de la cloroquina mejora la eficiencia de transfección y el título de virus posterior, alrededor de…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.