שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ"א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
צמחים מייצרים זרעים, אשר להצמיח את הדור הבא. זרעים לצבור כמויות גדולות של עתודות אחסון, כגון שמנים, פחמימות וחלבונים, לצמיחה שלאחר נביטה. בני אדם לנצל עתודות אחסון זרע כמקורות להאכיל במזון מן החי, ובכך זרעי צמחים הם אחד הספקים העיקריים של חומר אורגני אכיל ברחבי העולם. הגדלת תשואות זרע היא אתגר חשוב במדע צמח.
מאז עתודות אחסון הזרע הם מקורות בעלי ערך מסחרי של מזון וחומרים תעשייתיים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס רגולציה של חילוף החומרים של עתודות אלו נחקרו בהרחבה 1-6. להאיר עוד מנגנונים אלו יהיו שימושיים להגדלת תשואות זרע בגידולים. זרעים להתפתח השחלות צמח לאחר הפריה, והם בשלים דרך סדרה של שלבי התפתחות 1,6,7. בהמשך להבנת התפתחות הזרע הבסיסי המולקולרי מנגנון מחייב מפורט, פרופילי ביטוי גנים מדויקים מתוך סדרה של פיתוח זרעים להיות מיוצר. עם זאת, כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, פחמימות, ופוליפנולים זרעי צמחים להקשות לבודד RNA נקיים במיוחד, אשר מונע פרופיל מדויק של ביטוי גנים.
הנה, אנחנו מציגים שיטה יעילה בידוד RNA מן הבוטנים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, ופוליפנולים. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו להכין RNA הנקי במיוחד. RNA כזה יהיה שימושי עבור ניטור שינויים תעתיק בגנים מפתח שליטה על ויסות חילוף החומרים של עתודות אחסון זרע בפיתוח גרעיני שמן בוגרת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרופילי ביטוי גנים לתרום להבנתנו פיזיולוגית צמח; ולכן, שיטות בידוד הספציפי RNA פותחו עבור כל דגימת מצב 9-12. חקרנו את התהליכים עוכבו במהלך בידוד RNA מזרעים ומצא כי RNA מחייב ממברנות סיליקה היה עכבות קשות. כמויות גדולות של שמן, חלבונים, ופוליפנולים לעכב בידוד RNA. שינינו …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות של מתקן Genomics פונקציונלית מתקן Spectrography ו bioimaging, אמצעי מחקר Core NIBB, מתקן מחקר הצמח דגם, מרכז Bioresource NIBB.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
References
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
